小分子干扰RNA对食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C的抑制的研究.pdfVIP

·论文交流 · 高冬玲张红新陈奎生张岚宋一民张云汉 河南省肿瘤病理重点实验室；郑州大学第一附属医院病理科， 郑州 450052 淋巴转移是食管癌主要的转移方式，与患者预后密切相关，但其转移机制尚不清楚。近年来发现 血管内皮生长因子一C可介导淋巴管内皮细胞增殖分化，诱导淋巴管增生，促进肿瘤淋巴道转移。 解，从而抑制基因表达，称为RNA干扰(RNA 异性，是一种新兴的基因治疗技术。本研究构建了以人vEGF—C基因为靶标的siRNA质粒，经阳离子 淋巴转移机理及其治疗对策秉抗淋巴管生成提供实验基础。 ， 一、材料与方法 1． PCR试剂盒(AMV)购自 主要试剂：总RNA提取试剂TRIz01购自Invitrogen公司，RNA 技术有限公司，RPMI 脂质体细胞转染试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司，G418是GIBCO公司(宝信生物科技有 限公司分装)，胎牛血清为杭州四季青生物工程材料公司产品。 2．细胞培养与转染：人食管癌EC9706细胞系由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点 实验室惠赠。细胞单层贴壁生长于含体积分数lO％胎牛血清的PRIM1640培养液中，37℃、体积分 数4％C02培养箱内培养，隔日换液。根据VEGF．C siRNA质粒。重悬EC9706细胞于’RPMI 使之贴壁生长，细胞铺满率达90％，参照转染试剂盒说明书进行转染。转染48h后，换含800mg／L G418培养液筛选抗性克隆至2周 部死亡，其余各组也有80％～90％的细胞被杀死，换用含400mg／L 后，挑选阳性克隆，传代至培养瓶中继续常规扩大培养。 3． d后，倒置显 胞分别以l×10。／m1浓度转至6孔板中，孔内预先放置高压消毒的盖玻片，常规培养2 微镜下观察，待细胞均匀爬满，取出盖玻片，丙酮固定20min。参照免疫组化试剂盒说明，依次滴加 二甲苯透明，中性树胶封片，以PBS代替一抗作阴性对照。平行实验每组重复5次。 4．VEGF．C nlI矾A表达的检测RT-PCR和原位杂交检测VEGF．CmRNA的方法具体参照文献。 5．结果判断VEGF．C阳性染色均为淡黄色或棕深黄色颗粒，定位于细胞质内，每片随机每计数 10个高倍视野，得出阳性率，细胞质内不着色为阴性，细胞质内有细小黄色颗粒即为阳性。VEGF． CmRNA阳性反应为紫蓝色颗粒，定位于细胞质内，每片随机每计数10个高倍视野，得出阳性率， 细胞质内不着色为阴性，细胞质内有细小紫蓝色颗粒即为阳性。 6．统计学方法采用SPSS10．O统计软件进行方差分析和t检验，检验水准矗=0．5。数据以均数 ±标准差表示。 二、结果 1．转染后食管癌细胞VEGF．C蛋白表达免疫组化结果显示VEGF．C阳性表达主要定位于细胞质。 呈棕黄色，着色深浅不一。正常Ec9706细胞组和无关序列组细胞质内有棕黄色颗粒，大部分细胞表达 ％，二者相比，差异无显著性(P0．05)；转染组只有少量细胞VEGF—c阳性表达，且着色较浅， 性(PO．05)，与正常组和无关序列组相比，差异均有统计学意义(尸0．01)。 2．转染后食管癌细胞Ⅵ粥F-C 无关序列组均在229bp处有特异性vEG限．C基因条带，在480 bp处也有内参照a．actin条带，二者相对光 原位杂交显示阳性细胞胞质中有紫蓝色颗粒，而阴性细胞则未见紫蓝色颗粒。正常EC9706细胞 6．07)．％，二者相比分，差异无显著性(尸0．05)；转染组则少量细胞有阳性表达，表达率分别 与正常组和无关序列组相比，差异均有统计学意义(尸0．01)。 三、讨论 vEGF家族与肿瘤血管、淋巴管生成关系密切，其中VEGF．C与淋巴管生成有关，其基因定位于 管内皮细胞的有丝分裂，促进淋巴管生长，发挥淋巴管生成因子的作用。研究证实，ⅦGF-C的表达与 肿瘤细胞的高侵袭及转移特性有关。 对叮A干扰现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的序列特