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RNAi技术及其应用 集美大学生物工程学院 2011级研究生 微生物专业 陈丽娜 学号：2011227006 摘要 RNAi (RNA interference)是指外源性双链RNA(dsRNA)能抑制细胞内与其序列同源的基因的表达[1]，是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合，使之降解，从而阻止mRNA的翻译[2]。在进化上，这可能是生物调控基因表达及抵御病毒侵染或转座子诱DNA突变的一种共有的生理机制[1]。本文对RNAi技术的作用机制和应用进行了简单的介绍。 关键字 RNAi技术 siRNA/shRNA 作用机制 应用 引言 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近几年发展起来的新技术，是外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，被《Science》杂志评为2001年十大科技突破之一，名列2002年十大科学之首[3]。双链RNA 能导致转录后基因沉默最初来自于对线虫的研究。1995年，Guo和Kemphues试图利用反义和正义RNA影响秀丽新小杆线虫中par-1基因的表达，结果意外的发现二者同样地抑制了par-1基因的表达[4]。到1998年，Fire和Mello在秀丽新小杆线虫中注入dsRNA(正反链的混合物)，结果发现注入dsRNA 比单独注入正链或反链RNA引起基因沉默的效率要高得多。 目前，RNAi在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等面已显示出广阔前景。与此同时，RNA干扰分子机制的研究也取得了飞速发展，包括对转录水平、转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究。清晰阐述RNA干扰的作用机制将为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理论依据和有力工具。 1 RNAi的功能[2] 1.1 抗病毒功能：RNAi现象是近年来发现的一种新的调控基因表达的重要方式，但是研究发现，RNAi是一种非常保守的方式。所有的生物在长期的进化过程中都面临着病毒等外来生物的入侵，生物体如何使自己的基因组免受外来核酸的入侵呢？研究表明，RNAi机制在真核细胞中起着相当于人类免疫系统的作用，充当基因的保护者。生物体能够将外来的细菌、病毒等的核酸的RNA降解成dsRNA，将外源RNA特异地降解。 1.2 基因调控：在RNAi发现以前，人们认为基因研究中最重要的对象是DNA和蛋白质，而RNA只起到传送DNA信息的作用，甚至错误认为很多短的RNA是一些无用的物质。但到2000年，科学家在线虫幼虫体内发现了一类由20多个核苷酸组成的单链微小RNA，并将其命名为miRNA。此后，科学家又发现了miRNA 调控基因的功能，但小RNA起如此大的作用还是首次发现。在2005年1月14日发表于美国《Cell》杂志的论文中，怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员说，小 RNA 能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。 1.3 染色质浓缩：内源的siRNA，一些小RNA可能通过使染色质浓缩而调节基因表达。一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域，能通过一种使DNA甲基化的作用导致基因沉默；在蠕虫体内检测到许多Polycom蛋白(能结合染色质)，是RNAi过程所必须的；裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩，导致这个位点的基因转录沉默。 1.4 转座子沉默：目前，两方面的证据提示转座子沉默涉及siRNA。其一，发现蠕虫mut-7基因参与RNAi和转位抑制。其二，从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA，并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。由于中心粒区包含重复序列――含转座子片段，在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座子LTR(长末端重复序列)介导的RNAi，推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。 2 RNAi作用的分子机制[5] RNAi技术在众多领域都显示出巨大应用前景，RNAi机制的研究也不断取得进展，最早关于RNAi 机制的研究集中于转录后水平，随着研究的深入，学者发现 RNAi 的作用是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同水平上实现的。 2.1 siRNA/shRNA介导的转录后基因沉默 转录后抑制(post transcriptional gene silencing PTGS)是指内源基因在“异常RNA”的诱导下发生基因沉默的调控过程。被抑制的基因能够正常转录，但转录后的 mRNA产物会被迅速降解而失去正常功能。所以属于转录后