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不同精液稀释粉与保存温度对猪精液的保存效果 俞湘麟 吴昊晏 曹建国 孙东东 (1上海市动物疫病预防控制中心201103韩盛利 张佩华 吴金林 朱永军 2上海市农业科学院畜牧兽医研究所201106) 稀释精液的保存时间依稀释液及保存环境的不同而有很大差别，能够保证其活率在0．7的时限一般为5 d【1 。精子活力在0．5级以上才可用于人工授精【2-4 7，也有认为需达到0．6级以上 】。目前规模化猪场在实施人工授精技术时大多采用商品化的营养稀释粉，但由于供应渠道众多，采购时往往忽视商品的技术参数，把短效当成长效使用，或配制不精确、放置时间过长，这样就得不到应有的效果。本试验探讨不同的精液营养稀释粉在不同的保存温度下对猪精液保存效果的观察。 1 材料与方法 1．1 精液采集与测试时间 6头种公猪精液取自上海市3个种猪场，公猪耳号分别是：长白猪4009，杜洛克猪ll7—2、130—1、391、700、1406。检测由专职人员负责。测试时间自2006年11月13日至12月8 13止。 1．2 精液营养稀释粉 1．2．1 精液稀释粉：采用不同时效的4种精液稀释粉，市售的长效、中效、短效和自配稀释粉。自配稀释粉为：葡萄糖27．5 柠檬酸三钠6．9 g、碳酸氢钠1．0 g、乙二胺四乙酸二钠2．35 g、柠檬酸2．9 g、三羟基氨基甲烷5．65 g。1．2．2 稀释液配制：市售稀释液配制按照产品使用进行。自配稀释粉溶于1 000 ml蒸馏水中，自配好的稀释液使用前加入庆大霉素注射液tO ml／2支。 1．3 主要仪器 显微恒温板、恒温冰箱、意大利产Medi Chimica精液密度测定仪、精密分析天平及其它试验常规仪器。 1．4 试验设计 按常规采精法采集6头公猪的合格精液，用Medi Chimi—ca精液密度测定仪检测原精精子数，分别按每1O0 ml含40亿有效精子数进行稀释，每头公猪精液取4份，计24份。稀释时严格控制稀释液温度和原精温度相一致，缓慢加入，稀释过程在15 rain内完成。精液稀释完成后，标记、密封并用毛巾裹上一同置于17℃ 恒温冰箱内带回实验室。4份稀释精液分别保存于12、17、20、25℃ 恒温冰箱内，观察0～7 d的精子活力和精子学形态的保存效果，每天上、下午观察2次，每种营养稀释液重复6次。 1．5 精液品质检查 1．5．1 精子活力：检查时将稀释精液预热至37℃ ，取10～100 HI置干净的载玻片上，用22 mrfl 盖玻片盖上，在400倍显微镜下观察10个不同视野，分别记录精子活动状况。采用1O级制评力法估测视野中直线运动的精子占总精子的百分率，例有70％的精子呈前进运动，则活力为0．7，以此类推。1．5．2 精子活率：用10 mI试管取伊红染液(1％ 浓度)l mI，加入精液0．2 ml，置37℃ 水浴锅中恒温浸染20 min，取1滴伊红染后的精液，再滴加1滴5％苯胺黑或苯胺蓝混匀染色后抹片。用显微镜在400倍下观察，死精子染为红色，活精子不着色。每个抹片观察200个以上精子，得到活率，以 “％”表示。 2 结果 利用Micr0S。ft excel2000软件对不同稀释液处理的精液在不同保存温度下的保存时间、保存时间I}缶界点精子活力和存活率进行数据统计。__ 2．1 精子活力 4种不同营养稀释液稀释的精液，分别保存于12、17、20、25℃恒温冰箱内，观察0～7 d的精子活力，其结果如表1。表1 不同稀释精液在不同保存温度下的精子活力比较(单位：℃ 、级) 2．2 精子活率4种不同营养稀释液稀释的精液，保存予l7℃ 恒温冰箱内．染色镜检0～7 d的精子形态，其结果如表2。 表2 不同稀释液对稀释精液保存的精子活率比较 3 小结与讨论 3．1 适宜的保存温度 猪精液对温度较为敏感，温度较高时(25℃ )，可能增强了精子的运动量，消耗能量大，加剧精子衰老过程，存活时间相对短些；温度较低时(12℃ )保存效果也很差，据报道猪精子对低温很敏感，只能耐受15℃ 以上的温度，这涉及膜对温度的敏感性。本次测试结果表明以l7℃ 恒温保存为最适宜，与报道相符。但短效稀释粉和白配的稀释粉稀释的精液也可适当降低保存温度，有待进一步研讨。 3．2 适宜的保存时间 目前普遍认为精子活力在O．5级以上，也有认为需达到0．6级，精子活率0．7以上才能保证输精质量，所以在此以活力0．5级、活率0．7时的保存时间为参照，比较不同稀释粉对精液的保存效果。测试表明精液保存时间与产品特性相吻合，精子活力0．5级时，长效稀释粉稀释的精液在17～2O℃ 时可保存5．09～ 5．36 d，中效稀释粉稀释的精液在l2～l7℃ 时可保存3．O8～ 4．12 d，短效稀释粉稀释的精液在12～l7℃ 时可保存3．11～ 3．12 d，自配稀释粉稀释的精液在12～1