PCR技术研究新进展.pdfVIP

维普资讯 第22卷第4期 重庆工商大学学报 (自然科学版) 2005年8月 Vo1．22 No．4 Aug．2005 文章编号：1672—058X(2005)04—0322—04 PCR技术研究新进展 姜怀春 ，李 宏 (1．重庆工商大学 学报编辑部，重庆 400067；2．重庆教育学院 生命科学与化学系，重庆 400067) 摘 要：介绍了实时定量 RT—PCR的原理、方法和应用，包括 SYBRGreenI、AmpliSensor、 Lightcycle技术和Complex探针技术；同时还对原位PCR技术的原理、方法和应用，简并PCR的 原理、方法和应用作 了综述。 关键词：PCR；实时定量RT—PCR；原位PCR；简并PCR 中图分类号 ：Q819 文献标识码：A 由Mullis等在 1983年建立的PCR技术已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方 法 。近年来，该技术本身获得了长足发展，可靠性不断提高，在聚合酶链式反应基本原理的基础上，发 展了一系列新的概念和实验方法，在生命科学研究中具有重要价值。 1 实时定量 RT—PCR的原理、方法和应用 1．1 实时定量 RT—PCR的原理 实时定量PCR的发明归功于两个重要的发现：一是发现DNATaq酶有5— 3外切酶活性，二是利 用荧光能量传递技术构建了双标记寡核苷酸探针，即TaqMan探针。在PCR过程中，这些荧光信号可以被 探测器所 “即时”捕获，电脑软件可以通过等式 △R =R 一R 计算AR，其中，R 是表示每点测量的荧光 强度，R 表示荧光基线强度，AR 的值表示PCR过程中，探针降解的量，就是 PCR产物的量 。以△R 的值对循环数作 曲线，选择一个荧光阈值，荧光达到荧光阈值的循环数叫做阈值循环数(CycleThreshold， C。)，而c值随这些起始模板量的增加而线性降低，从而可以通过 c值推算起始模板量。该方法的特异 性由引物和探针的特异性所决定，只有在PCR过程中，探针退火到 目标片段才能发出荧光信号。 SYBRGreenI是一种DNA结合染料，能非特异地掺人到双链DNA中去，在游离状态下，它不发出荧 光，但一旦结合到双链 DNA中以后，便可发出荧光，可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中， 因此，在一个反应体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是能与非特异性双链DNA (如引物二聚体)结合，但其产生的干扰可通过熔解曲线分析得到解决 J。 分子信标(MolecularBeacons)，是一种单链 DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端 有淬灭基团，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，两者之间发生荧光信号能量 共振转移(FRET)，当热循环温度达到分子信标的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸 展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。 AmpliSensor技术：该技术与TaqmanPCR的区别在于其采用的是复合探针。一个探针上标 以荧光报 告基团，另一个探针上标以荧光淬灭基团，后者的5端较前者多出7个碱基(GCGTCCC)。两探针之间能 因碱基互补而结合，此时，两基团靠近而形成FRET结构，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。当两探 针分开后，其间的FRET关系受到破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号得到释放。在 收稿 日期：2005—01—17：修回日期：2005—02—25。 作者简介：姜怀春(1961一)，男，四川剑阁人，副研究员，从事生物化学研究。 维普资讯 第4期 姜怀春 ，等 ：PCR技术研究新进展 323 PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接，该引物的5端应具有一段与长探针上多出的7 个碱基互