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qPCR 检测敲减效率 实验方法 1/ 7 实验流程描述 培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将目的细胞分入6-well 培养板培养， 感染当天按实验设计的组别加入RNAi 慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3 天后荧 光显微镜下观察GFP 表达情况，感染5 天后收集细胞，采用RT-PCR 的方法检测目的基因 的mRNA 表达情况，进而判断靶点的干扰效果。 流程图 2/ 7 实验材料： 1．主要试剂 REAGENTS COMPANY Cat.No. Trizol Invitrogen 15596-026 M-MLV 逆转录酶 promega M1705 dNTP promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(RF) 上海吉凯 SYBR Master Mixture TAKARA DRR041B 胎牛血清 GIBCO A11-102 DMSO 上海生物试剂厂 DMEM GIBCO 胰酶 上海化学试剂公司 双抗 上海新先锋药业有限公司 Opti-MEM GIBCO 2 ． 主要仪器 EQUIPMENTS COMPANY Cat.No 生物安全柜 上海振梓创空气净化有限公司 Bio 1200- Ⅱ-A2 荧光显微镜 奥林帕斯公司 micropublisher 3.3RTV CO2 培养箱 日本三洋 MCO-175 稳压电泳仪 上海天能 PCR 仪器 ABI 公司 2720 thermal cycler Real time PCR 仪器 TAKARA 公司 TP800 3/ 7 实验设计： 目的细胞慢病毒感染实验在6 孔板中进行，每孔样品排列如下表所示： Group Scr-siRNA gene-siRNA results 2-ΔΔCt 说明： 1：Scr-siRNA 为正常目的细胞，加阴性对照病毒感染的细胞组（Negative Control）； 2 ：gene-siRNA 为正常目的细胞，加RNAi 靶点病毒感染的细胞组（Knock Down）； 实验步骤： 1．准备靶细胞 1.1 细胞复苏 1) 从液氮罐中取出细胞冻存管 2) 迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻 3) 完全解冻后，1000rpm，离心2min 4) 70%酒精擦拭冻存管消毒后，移至超净台 5) 吸去冻存液上清，加入 1ml 新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有