SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR法测定中华绒螯蟹基因组大小.pdfVIP

维普资讯 江苏农业科学 2007年第5期 SYBRGreenI实时荧光定量PCR法测定 中华绒螯蟹基因组大小 朱泽远 一，杨 杰 ，施用晖 ，乐国伟 (1，江南大学食品科学院／教育部食品科学与工程国家重点实验室，江苏无锡 214122；2．江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏南京210014) 摘要：基于BIO—RADiCycler ，利用 SYBRGreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性，以已经 测序的水稻样品(Nipponbare)为对照，建立一种实时PCR方法定量检测中华绒螯蟹基因组大小。整个过程约 120rain，PCR效率为97．8％，标准曲线为 ：一3．768x+44．568，标准曲线的相关系数 (R)为0．992。结果表明， 中华绒螯蟹的基因组大小为 1．72±0．25Pg。研究不仅首次报道了中华绒螯蟹的c值，还表明基于SYBRGreen I的定量PCR方法可为基因组大小的定量检测提供了一种特异、快速和简便的方法。 关键词：中华绒螯蟹；C值；实时荧光定量PCR 中图分类号：$966．16 文献标识码：A 文章编号：1002—1302{2007)05—0164—03 中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)自然分布于我国 结果可靠 。实时PCR，又叫Q—PCR(Quantitative 的沿海及内陆十多个省市，其蛋白质含量高、肉味鲜 polymerasechainreaction)，它不仅能检测特异产物 美，经济价值极高，是我国名贵水产品种。我国河蟹 是否合成，还能检测其生成量(拷贝数)，现已逐渐 年产量已猛增到40多万 t，年产值超过200亿元。 成为实验室的有力工具。迄今，未见运用实时PCR 当前存在的主要 问题是中华绒螯蟹相关研究较薄 测定未知生物基因组大小的研究报道。 弱，还处于起步阶段，如品种鉴定困难 ，品种混杂、退 本研究以已经测序 的水稻样品为参照，运用实 化十分严重 。迄今，尚未见中华绒螯蟹基因组大 时PCR测定中华绒螯蟹的基因组大小，检测这一方 小的研究报道。 法的可靠性和通用性，为中华绒螯蟹生物鉴定和分 基因组大小指单倍体中DNA含量，也叫C值或 类提供实验依据。 T值。基因组大小是生物的基本特征，在物种分类、 1 材料和方法 鉴定和进化等方面有重要意义。基因组大小的测定 方法主要是孚尔根 一显微分光光度计法和流式细胞 1．1 样品来源 术法。孚尔根 一细胞显微分光光度计法是早期常使 中华绒螯蟹来 自江苏省宜兴市和桥镇人工养殖 用的方法，但测定结果变异较大 。流式细胞术法 场 。水稻样品(籼稻 Nipponbare)由新加坡 Temasek 不仅需要专用流式细胞仪，还存在其他不足之处，如 Lifesciences实验室顾克宇博士馈赠。 目前国际上还没有一个统一的测量 DNA含量的标 1．2 DNA分 离 准参照物，要进行DNA绝对含量测定，采用不同内 采集中华绒螯蟹大腿肌肉组织，其基因组DNA 标时结果存在误差；此外，流式细胞术法采用不同的 采用酚 一氯仿法分离，包括用 RNA酶 (Qiagen，美 核荧光染料所检测出的结果也有明显的差异 。 国)降解 RNA(37℃ RNA酶处理 200 样 品l0 Wilhelm等首次运用实时 PCR(Real—time min)。水稻样品的部位为叶，提取的DNA通过琼脂 PCR)方法测定 已知基因组大小的酵母 (Saccharomy- 糖胶电泳后溴乙锭处理，紫外光下显色，确定其基因 cescerevisiae)、花斑剑尾鱼 (Xiph