浅谈从血凝块中制备基因组DNA.pdfVIP

广东食品药品职业学院 毕业论文 浅谈从血液凝块中制备基因组DNA 朱凤琴 110520102048 10 生物制药技术2 班 生物制药技术 生物技术学院 李脉 2013 、04、01 浅谈从血液凝块中制备基因组DNA 生物技术学院，10 生物制药技术2 班，朱凤琴 【摘要】目的 从人血液凝块中提取基因组DNA。方法 室温自然解冻，机 械磨碎，高盐、高EDTA 提取液处理，消化液消化，酚氯仿抽提。结果 用改良 酚氯仿法从人血凝块中成功提取基因组DNA，提取的DNA 浓度为：(32±10)mg/L， 且光吸收比值A260/A2801.6。结论 用改良法提取的基因组DNA 的总量较高， 提取效率高，PCR 扩增效果好，可很好的用于血凝块基因组DNA 的提取。 【关键词】血样保存；血凝块；DNA 制备；PCR 扩增；琼脂糖电泳；聚合酶 链式反应 血样采集通常都会使用抗凝剂，但是在实操中总会遇到血凝块的情况。从而 影响我们的DNA 制备工作开展。常用EDTA 的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血 [1] 液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 。 血液凝块是指血液中红细胞在化学试剂、有毒物质、生物物质、温度等作用聚合 成为块状物的现象。凝血后血液由溶胶状态变成为凝胶状态的血凝块。如在纤维 蛋白的网状作用下将红细胞收在一起形成了血液凝块。 1.材料与方法 1.1 材料 血样为中华骨髓库所提供，一共抽做12 份样品，加抗凝剂的血液于4 ℃保存 1.2 方法 1.2.1 基因组DNA 制备 样品于室温解冻后，从血液中吸取凝块约1000ul 置于15ml 离心管，加入3ml 生理盐水浸泡15min。6000r/min 离心8min，弃上清。将沉淀磨碎于胶状（勿过 度）加入1000ul 提取液（10mmol/lTris-Hcl、100mmol/lNacl、10mmol/lEDTA、 2%SDS)，浸泡30min，其中每10min 颠倒数次。6000r/min 离心5min,吸出上 清，加入500ul 消化液（10mmon/lTris-Hcl、1mmol/lEDTA、20g/lSDS、300ug/ml 蛋白酶K），56℃漩涡振荡温浴1 小时，然后于37℃温浴过夜。加入等体积的饱 和酚，充分颠倒混匀。10000r/min 离心5min。取上层水相加入加入等体积饱和 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1 ），充分颠倒混匀后，10000r/min 离心5min 。吸取 上清加入氯仿：异戊醇（24:1 ）500ul，充分颠倒混匀，1000r/min 离心5min， 吸取上清，加入1/10 体积的NaAC(300mon/l),充分颠倒混匀,再沿管壁缓慢加入 2 倍体积的预冷无水乙醇 。1000r/min 离心5min.倒掉上清后，用预冷75%乙醇 洗涤，1000r/min 离心5min，倒掉上清，尽量把酒精吸干后倒置于吸水纸上， 室温晾干（或真空抽干），加100ul56℃温浴的TE 把DNA 溶解（10mmol/lTris、 1mmol/lEDTA）。 1.2.2 基因组DNA 的浓度及纯度检测 用紫外分光光度计N-800 检测，用纯水初始化后，有TE 空白。 结果如下表 Curso Curso Sampl 260/2 260/2 340 Conc. Units A260 A280 r r e ID