DNA的复制、修复与重组DNA技术.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 目的基因DNA片段 DNA载体 工具酶 重组DNA分子 导入 宿主细胞 筛选 选择标志 杂交 酶切、测序 抗药性标记选择(插入失活法) DNA印迹(Southern Blot) 双脱氧末端终止法(Sanger法)测序 DNA自动测序 目的基因DNA片段 DNA载体 工具酶 重组DNA分子 导入 宿主细胞 筛选 扩增、表达 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ④以延长的端粒DNA单链为模板，3’-OH为引物合成富含CA的互补链 ⑤不断延长至补齐引物缺口 哺乳动物中端粒末端形成大的环状结构， 环状DNA + 蛋白质→保护染色体3’端的稳定 端粒的环状结构 生殖细胞、干细胞：有端粒酶活性 体细胞：无端粒酶活性，端粒随分裂而缩短， 最终导致细胞衰老、调亡，是正常的 生理现象。 肿瘤细胞：端粒酶活性重新出现，对端粒进行补 偿，使之永不衰老，形成恶性增殖。 第四节 DNA的损伤与修复 1. 自发的因素 一、造成DNA损伤的因素 周围环境溶剂分子的随机热碰撞 嘌呤碱脱落 胞嘧啶自发脱氨成尿嘧啶 UV 2. 物理因素 (1) 紫外线损伤 产生嘧啶二聚体 (2) 电离辐射的损伤 产生碱基破坏，分子交联，单链端裂等 3. 化学因素 二、DNA损伤的类型 转换——同型碱基变异 颠换——异型碱基变异 启动子/剪接信号——影响整个基因功能 编码序列——蛋白质功能改变 中性变化——氨基酸变化，功能不变 静止突变——碱基变，氨基酸不变 发生部位 1. 点突变 镰状红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · C 肽链 基因 正常成人Hb(HbA)β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · C 肽链 CTC GAG 基因 CAC GTG 正常人Hb(HbA)：β链N端第6个氨基酸为Glu 镰状红细胞贫血病人Hb(HbS)：β链N端第6个氨基酸为Val 2. 缺失 一个碱基/一段核苷酸链/整个基因 3. 插入 一个原来没有的碱基/一段核苷酸序列 4. 倒位 DNA链内部重组，一段方向颠倒 三、修复机制 1. 光修复机制 280nm 239nm (1) 不需要光复活酶 嘧啶单体 嘧啶二聚体 (2) 需要光复活酶 嘧啶单体 嘧啶二聚体 UV (+) 光复活酶 2. 切除修复(暗修复) 切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制：原核生物中主要由DNA-polⅠ和连接酶完成，真核生物机制类似。 人遗传性疾病如着色性干皮病由于缺乏UV特异内切核酸酶造成的。 OH P DNA聚合酶Ⅰ OH P DNA连接酶 ATP 8个核苷酸 4个核苷酸 UVrABC切割酶 UvrA UvrB UvrC DNA损伤的切除修复 3. 碱基切除修复 DNA糖苷酶识别切除损伤的碱基 AP核酸内切酶切除AP附近的磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ填补 DNA连接酶连接 DNA聚合酶Ⅰ OH P DNA连接酶 AP核酸内切酶 C G U G DNA糖苷酶 G OH P U DNA聚合酶Ⅰ P-P G DNA中的C容易突变成U 尿嘧啶DNA糖苷酶——识别DNA中的U(由C 突变而来) 若DNA中存在U，无法区别突变U和正常U 所以DNA中U甲基化/耗能生成T DNA碱基中T的存在，增加遗传信息的稳定性 RNA中的U ：数量多/半衰期短/经济 DNA碱基的组成为何是“T”? 第五节 重组DNA技术 自然界常见现象 两个DNA分子间/一个DNA分子的两个不同部位之间→链断裂和片段交换重接→改变基因的组合和序列 交换可发生在同一细胞内(间)/不同物种 DNA重组(recombination of DNA) 实验室，人工的方法 方法：不同来源/不同种属的DNA片段 拼接成重组DNA分子 引入活细胞内 筛选鉴定后，大量扩增并表达 重组DNA 技术 基因工程/遗传工程/分子克隆 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体 克隆(clone) 把一个生物体中携带的某一特定的遗传信息，通过一定的方法转移到另一个生物体中，使