基因工程原理与技术（ 第二版） 教学课件 作者 刘志国 主编 补充网络材料.docVIP

第二章 基因和基因表达 5 一、染色体外的遗传物质——质粒 5 1．质粒的概念与遗传控制 5 2．质粒的类型 5 3. 质粒的遗传控制 5 二、转位基因 6 1. 插入序列 6 2. 转座子 6 3. 可转座的噬菌体 7 第三章 核酸的分离与分析 7 一、核酸探针的制备 7 （一）探针的种类及其选择 7 （二）各种标记物及其选择 8 1. 放射性核素 8 2. 非放射性标记物 9 （三）探针的标记方法 10 1. 切口平移法（nick translation） 10 2. 随机引物法（random priming） 11 3. 末端标记法 11 4. 生物素探针的化学标记方法 12 （四）非放射性标记探针的检出 12 1. 杂交体与检出系统专一性的偶联 12 2. 显色 12 二、核酸杂交种类与方法 13 （一）膜上印迹杂交 13 1. 固相支持物的选择 13 2. 硝酸纤维素滤膜（nitrocellulose filter membrane） 14 3. 尼龙膜（nylon membrane） 14 4. 化学活化膜（chemical activated paper） 14 5. 滤纸 15 （二）Southern印迹杂交流程 15 1. Southern印迹杂交分析主要包括以下主要步骤： 15 2. 具体操作方法与步骤 15 第四章 核酸分子的酶切、连接和修饰 19 一、DNA聚合酶 19 1、大肠杆菌DNA聚合酶I 20 2、大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段（Klenow酶） 20 3、T4 DNA 聚合酶 20 4、Taq DNA聚合酶 21 5、Pfu DNA聚合酶 21 6、逆转录酶 21 二、核酸外切酶 22 三、其他类型核酸内切酶 23 1. S1核酸酶 23 2. 绿豆核酸酶 23 3. Bal 31 23 四、琼脂糖酶 23 第五章 基因工程载体 24 一、质粒的生物学特性 24 1. 质粒的转移性 24 2. 质粒的不相容性 24 二、pSC101质粒载体 25 三、M13噬菌体载体 25 1. M13噬菌体的生物学特性 25 2. M13噬菌体载体的构建 26 3. 常用的M13噬菌体载体 27 4. M13噬菌体载体优缺点 27 5. M13噬菌体载体的应用 27 四、噬菌粒载体 28 五、代表性的原核表达载体 30 1. 非融合型表达蛋白载体pKK223-3 30 2. 分泌型克隆表达载体pinⅢ系统 30 3. 融合型蛋白表达载体pGEX系统 30 4. 包涵体表达载体 31 六、人工染色体载体 31 1. 噬菌体P1衍生的人工染色体（PAC） 31 2. 哺乳动物人工染色体（MAC） 32 第六章 目的基因克隆 32 一、DNA合成的原理 32 （一）发展历史 32 1. 早期研究与H-亚磷酸酯（H-phosphonate）的合成 32 2. 磷酸二酯合成 33 3. 磷酸三酯合成 34 4. 亚磷酸三酯合成 34 （二） 核苷亚磷酰胺构件 35 （三）固相合成支持物 35 （四）固相合成循环 36 （五）合成后处理 36 二、cDNA文库的种类 37 1. 标准化cDNA文库 37 2. 差减cDNA文库 37 3. 固相cDNA文库 38 4. 微量RNA的cDNA PCR文库 38 5. 酵母双杂交文库 38 6. RACE cDNA文库 38 7. 限制性cDNA文库 39 8. mRNA差异显示文库 39 三、DDRT-PCR技术的改进 39 四、随机突变 41 （一） 紫外线诱变 41 （二） X射线的诱变 41 （三） 热的作用机理 42 （四） 化学诱变剂的作用 42 （五） 使用致病菌株 43 （六） PCR介导的随机突变 43 （七） DNA 改组 43 第七章 原核基因工程 45 一、 相关发酵的反应器 45 1. 机械搅拌发酵罐 45 二、 发酵条件与控制 49 ⒈ 培养基的影响 49 2. 接种量的影响 50 3．温度的影响 50 ４．溶解氧的影响 51 5. pH的影响 51 6. 诱导时机的影响 52 7. 发酵过程最优化控制 52 第十章 植物基因工程 53 一、T-DNA转移 53 二、一元载体和双元载体 54 1.一元载体系统 54 2. 双元载体系统 55 三、转基因植物筛选与鉴定——gus基因的检测 56 1. X-Gluc的组织化学染色定位法 56 2. 4-甲基伞形酮酰-β-葡萄糖醛酸苷的荧光法测定GUS活性 57 3. 对硝基苯-β-匍萄糖酸苷的分光光度法 57 四、植物基因工程应用举例 57 1. 控制果实成熟的转基因植物 57 2. 抗病毒植物育种 58 3. 转基因花卉植物 59 4.利用转基因植物生产有重要价值的药用蛋白 59