经典细胞实验.ppt

细胞生物学实验 二、 实验原理 ③凝集素是一类含糖的 少数例外 并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。　　④凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。 三、实验仪器 二、 实验原理 三、实验仪器 二、 实验原理 ③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态 三、实验仪器 二、 实验原理 三、实验仪器 二、 实验原理 ②原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。 三、实验仪器 ④在25～28℃黑暗条件下，酶解2～3h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O洗液，用注射器向离心管底部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与0.2mol/LCaCl2·2H2O之间，破碎的细胞残渣沉入管底。 ⑤用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出 注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液 ，放入另一干净的离心管中．加4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O悬浮，1000rpm离心2～5分钟，弃上清． 实验内容与实施过程 ⑥将收集的原生质体悬浮在适量的DPD培养基中，用血球计数板调整原生质体密度为5×104/ml（请参考细胞计数）之间。 ⑦用带皮头的移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放5ml。 ⑧用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行暗培养。 实验内容与实施过程 5、培养结果的观察（活力检查，细胞壁再生的观察，细胞分裂的观察）:在课外由教师指导学生进行. 实验的意义 植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。 二、 实验原理 动物的游离细胞在电刺激下可进行细胞融合，且具有融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。 三、实验仪器 实验总结 在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。 为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水 三蒸水或四蒸水 来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质．如甘露醇、山梨醇或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。 二、 实验原理 三、实验仪器 二、融合方法 ?1、取制备的鸡红细胞 制备方法同实验六 悬液lml，加入4min0.85％生理盐水，混匀后以1000-1200r/min离心5min，去上清液后．再以上述条件离心洗涤两次 5min、10min ，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9的生理盐水，其它条件同上。 2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入2—3mlGKN液，混匀后待用。 3、取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2×10 5 个，瘤细胞每毫升含1.5×l0 5 个。 4、如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液1ml,加入50%的PEG液混匀，置于30℃水浴内温育lO~15min； 5、用吸管或移液器吸取以上细胞悬液0.1--0.2ml，滴在薄底小培养皿中，利用倒置显微镜进行观察。 五 实验结果的观察 同核体 异核体 实验总结 我们的实验证明，有条件如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂，配制成6％--8％的PEG（Mw 000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高． PEG有毒性，提醒学生在操作过程中一定要注意，避免沾上皮肤。 实验作业 1．酶解液及原生质体起始培养基中，为何要保持较高渗透压？ 2.如何判断分离原生质体的活力和新壁再生？ 实验总结 将原生质体培养分化过程进行显微摄影，并分析结果。以植物根、茎、叶、叶柄作为原生质体的分离材料,经过分离收集在一定条件下才能培养获得完整的原生