副猪嗜血杆菌gapdh基因的克隆、表达与免疫原性研究.pdfVIP

122 国家星火培训计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 副猪嗜血杆菌gapdh基因的克隆、表达 及免疫原性研究，-c 付书林¨，张敏敏，袁芳艳，胡进，陈焕春，贝为成··· (华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，华中农业大学动物医学院，武：汉．430070) 摘要甘油醛．3．磷酸脱氢酶(GAPDH)是副猪嗜血杆菌细胞壁上的一种重要蛋白质，可能与该菌的免疫 杆菌BL21中表达，蛋白大小约为38l(Da，与预期结果相符。进一步通过Westernblot检测，证实GAPDH具 试验结果表明：该蛋白对小鼠具有很好的免疫保护，是一种很好的疫苗抗原靶标。 关键词副猪嗜血杆菌；甘油醛．3．磷酸脱氢酶；原核表达；免疫保护 目前，我国很多省市患病猪群中均可分离获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus 已给我国养猪业带来了巨大的经济损失。HPS的抗原成分复杂，已经毒力因子很少，而且各毒力因子的作 用机理及毒力因子间的作用关系目前尚不清楚。甘油醛．3．磷酸脱氢酶(GAPDH)是副猪嗜血杆菌细胞壁上的 一种重要蛋白质，具有良好的免疫原性，可作为亚单位疫苗候选蛋白。本实验用pET28a原核表达系统表达 研制Gl舔se瑙病新型亚单位基因工程疫苗奠定基础。 1．材料与方法 1．1PCI咿增gapdh基因 将经PCR和酶切鉴定正确的pMDl8．T-gapdh质粒送往大连宝生物公司测序。 1．2重组细菌的诱导表达及Westernblot鉴定 化试剂盒纯化。用标准阳性血清进行免疫印迹实验，检测其免疫学活性。 1．3免疫保护性试验 疫加等量弗氏完全佐剂，2周后加等量弗氏不完全佐剂进行第2次免疫，第2次免疫10d后，以 5．5x109CFU(5LD50)对BALB，c腹腔攻击，观察l周，计算小鼠死亡数。 2．结果与分析 PCR反应后产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条扩增片段大小约为1020bp的带，大小与预期结果 国家星,Y,培i／q计划及国家农业行业科技：第十届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会论文集 123 处有一条明显的表达带，与预期分子量大小相符。Westernblot表明，该蛋白具有免疫学活性。 免疫对照组全部死亡，i正n)]pET28a—GAPDH融合蛋白具有良好的免疫原性。 表1融合蛋白的免疫保护性试验 No．of animals／ No． surviving Group totalnO．of animals l rGAP 4／8(50％) 2 PBS 0／8(0％) 本实验表达的融合蛋白免疫保护率仍然不是很高，究其原因可能是HPS毒力因子过于复杂，单一的抗 原表位不足以对全菌产生足够的免疫保护作用。在本实验的基础上，若能找到其他具有较高免疫原性的蛋 白或蛋白片段，再将其进行相应组合，相信能够取得更好的免疫保护效果。 参考文献：(略)