细胞凋亡检测.docVIP

Hoechst 法： 原理：Hoechst是与DNA特异性结合的活性染料，为膜通透性荧光染料，主要结合在DNA的A-T碱基区，紫外光激发时发明亮的蓝色荧光。正常细胞Hoechst着色形态呈圆形，淡蓝色。早期凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色边集，晚期凋亡细胞核呈分叶、碎片状，并产生凋亡小体。 步骤： 1．在24孔板中预先加入盖玻片 2．细胞消化后加入24孔板中，培养24 h后加入药物，继续放入培养箱培养。 3．药物作用完成后，取出24孔板，去掉培养基，用PBS清洗两次。 4． 加入固定液（甲醇:冰醋酸为3:1，现配）1 mL/孔，固定15 min，重复固定一次。 5． 吸掉固定液待其自然干燥，加入Hoechst（Hoechst储备液用PBS稀释，浓度为1 %，现配，搅拌半小时后使用），避光染色45 min。 6． 吸掉染液用PBS洗三次，待其干燥，用荧光显微镜镜检，拍照。 TUNEL染色法：（CALBIOCHEM公司） 原理：细胞凋亡时，核酸内切酶被激活，染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，产生与DNA断点相同的3’-OH末端，在一定缓冲液体系下TdT将结合有荧光素dUTP不需要模板标记到缺口3’-OH末端，发绿色荧光。一旦细胞发生凋亡，细胞染色体发生断裂，经TUNEL染色，细胞在荧光显微镜下观察，能看到绿色荧光。 步骤： 1．细胞消化后加入6孔板中，培养24 h后加入药物，继续放入培养箱培养。 2．药物作用完成后，取出6孔板，吸取细胞悬液，1500 rmp离心10 min，并用胰酶消化贴壁细胞，1500 rmp离心10 min，PBS清洗3次。 3． 按照TUNEL试剂盒要求操作，对细胞DNA进行染色，具体过程如下： 3.1加入固定液(4 %甲醛溶解在PBS中，pH 7.4,现配)，在室温固定10min。 3.2 4℃, 1000 rpm 离心5 min，弃甲醛/PBS。 3.3 加入80%乙醇，4℃固定细胞（固定的细胞可保存2-6个月）。 3.4 1000 rpm 离心5 min，弃乙醇。加入200 μL TBS, 室温10－15 min。1000 rpm 离心5 min，弃TBS。 3.5 用10mM Tris pH8 以1:100稀释2mg/ml 蛋白激酶K。200 μL 20 μg/ml 蛋白激酶K孵育细胞5 min(不要孵育过度)。1000 rpm 离心5 min，弃蛋白激酶K。 3.6 dH2O稀释5×TdT 平衡缓冲液。100μL 1×TdT 平衡缓冲液室温下孵育细胞10－30min。1000 rpm 离心5 min，弃1×TdT 平衡缓冲液。 3.7 准备TdT 标记反应液：57μL Fluorescein-FragELTM TdT标记混合液+3μL TdT酶。37 ℃ 60μL TdT 标记反应液避光孵育细胞1－1.5h。 3.8 TBS洗，细胞悬液涂片，专用Hoechst封片剂封片随机选取3个视眼分别在荧光显微镜观察拍照，计数，根据公式计算凋亡率(AR)。 AR＝凋亡细胞数（荧光显微镜下所观察的绿色荧光细胞）/总细胞数（荧光显微镜下所观察的蓝色荧光细胞） 流式细胞仪测细胞凋亡（BD公司的Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒） 原理：PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。但PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是晚期凋亡或坏死细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。 步骤： 1．细胞消化后加入6孔板中，培养24 h后加入药物，继续放入培养箱培养。 2．药物作用完成后，取出6孔板，吸取细胞悬液，1500 rmp离心10 min，并用胰酶消化贴壁细胞，1500 rmp离心10 min，冷PBS清洗3次。 3．具体方法参照Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒要求操作： 1．加入1× binding buffer，使其再悬浮，制成细胞浓度为1×106个/ml的悬浮液，加入5 μL的Annexin V