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兽医部分 763 Asial型口蹄疫病毒YNBS／58株基因组特征及其表达研究 独军政。 常惠芸” 丛国正林形 邵军军 沈小燕 才学鹏谢庆阁 (中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州 730046) 达栽体中诱导表达。表达产物经SDS—PAGE和Western 肠杆茵中的高效表达。重组蛋白均以不溶性的包涵体形式存在于茵体中。利用蛋白纯化试剂盒对重组蛋白进行了有效纯 化。 关键词：sial型口蹄疫病毒；基因组特征；结构蛋白；表达。 disease 口蹄疫病毒(foot—and—mouth ORF编码一个聚合蛋白，它可被蛋白水解酶裂解为VPl、VP2、VP3、VP44种结构蛋白和L、2A、2B、2C、3A、 381、382、383、3C、3D 年，Asial型FMDV被首次分离于巴基斯坦[2]。我国于1958年在云南省保山地区首次发现Asial型口蹄 疫。2005年，Asial型FMD在我国部分省市引起暴发流行，给畜牧业造成了重大的经济损失，严重影响了 国家声誉。本研究利用RT—PCR方法对YNBS／58株的基因组序列进行了测定，并与参考毒株的核酸序列 及推导的氨基酸序列进行了比较分析，在此基础上，分别实现了重组结构蛋白P1、、伊l、VPIC末端(cVPl) eDNA及病毒基因和蛋白功能的研究奠定了基础。 1材料和方法 1．1病毒、引物、质粒 A22／550 Azerbaijan 1／60(AY593849)； ·作者简介：独军政(1976一)，男，甘肃礼县籍，研实员，在读博士，分子病毒学。 ··通讯作者：常惠芸(1965一)，女，河南许昌籍，研究员，博士，分子病毒学；Tel：0931—8342052。 764 2006学术年会 28a由本课题组保存。 1．2病毒RNA提取、RT—PCR、克隆测序 Mini 参考RNeasy RNA 理。RT—PCR参照TakaRaPCR kit说明方法进行。将所有PCR产物克隆到pGEM—Teasy载体，经酶 切和PCR鉴定后委托宝生物(大连)工程公司测序。 1．3序列分析 借助DNAstar、Mega3．1等软件将YNBS／58株基因序列与参考毒株的序列比较分析。 1．4原核表达载体构建 切处理的表达载体连接并进行确证性测序。 1．5重组质粒诱导表达 将测序正确的重组表达质粒再次转化受体菌，在培养平板上挑取单个菌落接种于LB液体培养基中， 370C摇床培养，待OD锄值达到0．3～0．5时，加入终浓度为0．6mmol／L的ltrlG进行诱导表达。 1．6表达产物的鉴定和纯化 将诱导表达的菌样裂解处理后，SDS—PAGE观察结果，然后进行Westernblot，一抗用Asial型El蹄疫 病毒牛阳性血清，二抗用辣根过氧化物酶(imP)标记的兔抗牛I毋。重组蛋白确认成功表达后，将诱导表 达的菌体收集后，于冰浴上进行超声破碎，4。C Ni—NTA蛋白纯化和复性试剂盒说明书方法对重组蛋白纯化。 析表达产物的可溶性。按BugBuster 2结果 2．1 YNBS／弱株基因组序列测定 7UTR长106Int，其中S片 基因依次包括255、657、654和633个碱基，分别编码85、219、218、211个氨基酸。5 7UTR 段长37Int，核糖体进入位点(mEs)片段435nt，功能未知区255nt；3113nt，该基因组序列在GenBank中 的登录号为AY390432。 2．2 YNBS／58株的遗传进化分析 将YNBS／58株与其他17个参考毒株的基因组序列进行比较分析并绘制系统发生树，结果显示YNBS／ 酸同源性比较发现，非结构蛋白基因区的同