FISH技术在牛性控分离精子比率鉴定中应甩研究.pdfVIP

58 2008学术年会 FISH技术在牛性控分离精子比率鉴定中的应甩研究‘ 庄新杰” 陆阳清 孙 雷 许 凯 张 明～ 卢克镁 (广西大学动物繁殖研究所 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室 广西南宁530005) 摘要：本试验借助显微操作仪分离牛的x和Y染色体，经DOP—PCR(degenerateoligonu—cleotideprimer—PCR)扩增后 insitu 式细胞仪所分离的牛精子进行荧光原位杂交(fluorescence 的性染色体上有明显的杂交信号；牛正常精子杂交结果显示x精子占47．3％，Y精子占48．7％。接近于正常精子中x、Y精 子各占50％的理论值；分离的牛Y精子和x精子杂交结果显示Y精子的纯度为86．2％，X精子的纯度为88．3％，而流式细 胞仪重分析的纯度分别为87．6％和90．1％，两种检测方法所得到结果没有显著差异。这表明本试验运用FISH技术成功鉴 定了牛分离精子的纯度，该方法的成功建立也为其他分离XY精子的方法所分离的牛精子进行纯度鉴定提供了一套可靠 的途径。 关键词：牛；分离精子；比率；探针；荧光原位杂交 精子间期核荧光原位杂交(FISH)是近年来检测非整倍体精子和鉴别x和Y精子的新方法，具有荧 光信号直观、易分辨、实验结果准确可信短和时间内能分析大量精子等优点，在一定程度上取代了繁琐费 时的人精子一仓鼠卵融合技术。Barlow等…曾用阿的平对人类精子核Y染色体长臂染色，通过荧光信号 判断Y染色体的数目，从而判定是否是Y精子。在畜牧业中，性控分离精子在生产特定性别的动物方面 具有极大的优势，因此流式细胞仪分选精子的应用越来越广泛。然而，流式细胞仪分离精子法对分离准 确率的鉴定基本都是采用仪器本身的重分析法，就方法论而言，需利用本身技术体系以外的手段鉴定其 分离精子的准确性和可靠性，而FISH提供了一种独立的分离精子纯度检测手段。在我国则尚未开展这 方面的研究。本试验借助显微操作仪显微分离牛中期的x、Y染色体，利用DOP—PCR技术进行微克隆， 原位杂交探针并运用该探针与牛的中期染色体、正常精子和分离精子进行荧光原位杂交，以期建立一种 独立评估分离精子纯度的手段。 1材料与方法 1．1 材料 1．1．1血液样品本试验采集的荷斯坦奶牛血液和新鲜精液，由广西大学奶牛场提供。 1．1．2试剂一生骏淋巴细胞培养液购自广州拜迪生物医药有限公司；DNA探针原位杂交检测试剂盒 dlYIP购自美国Sigma公司，其它试剂均为国产普通分析纯。 tit基金项目：广西科学研究与技术开发项目课题(桂科转0626001—3—1)；国家科技支撑计划项目(2006BAD04A18)。 ·--通讯作者：张明．教授，博士生导师；E—mail：mi咖@gxu．edu．Crl。 动物遗传与育种 59 服务有限公司合成。 1．2方法 1．2．1 牛中期染色体的制作、性染色体的识别和显微分离采用外周血淋巴细胞短期培养及染色体标 本制备的常规技术制作牛淋巴细胞中期染色体标本；在改装的显微操作仪下，用0．2ttm的微玻璃针借助 显微操作柄轻轻的刮取目标染色体。将刮取的染色体连同玻璃针一同折断于PCR管中，每管放10～20 个同一性染色体(x或Y)，于12000dmin瞬时离心，一20℃保存备用。注意整个操作过程须在无菌室内 小心操作，以防止内源和外源DNA的污染。 mL)0．5皿于37℃保温30min，后于96E的热水中保温10min，以灭活蛋白酶K。试验参照文献[3]的过 程，相应参数进行了修改。第一轮的PCR反应体系为模板混合液5止、10×Buffer2．5皿、引物(25pmol／ 止)2．5 参数设置为：94℃9 l 1．5min，72℃3rain；9个循环；72℃延伸5 rain；94。Cmin，33．5。C min。然后取5止 初级PCR产物为模板进行次级扩增，反应体系与上述相同。第二轮的PCR反应参数设置为：94℃4min； 940C1 1 min；590Cmin，72℃5min，25个循环；72。C延伸10min。初级和次级PCR产物在l％琼脂糖胶中电 泳并观察结果。