细胞培养室的使用与维护.pptVIP

评价细胞毒活性的 两周六日 药物的细胞毒实验 对正常细胞，是药物的毒理实验 对肿瘤细胞，是药物的抗癌活性筛选实验 关键词：细胞、细胞培养技术、细胞实验 细胞培养室的安全防护 紫外线的防护 细胞污染物的防护 有毒试剂的防护 液氮的防护 星期一 一 细胞房的清洁 无菌室和隔离间—新洁尔灭/75%乙醇 超净台—擦洗，紫外灯照射30min以上 CO2孵箱的调试—擦洗后高温消毒 二 实验器材的清洗与消毒 进口：离心管、培养瓶、冻存管 玻璃仪器：滴管、储液瓶 滤器：蔡氏过滤器、滤膜 枪头、EP管 星期二 一 孵育箱调试、烧制新鲜三蒸水 二 培养液的配制 培养液—维持体外细胞生存和生长 天然培养基：血清、血浆、组织提取液 优点：培养效果好 缺点：成分复杂、不易控制、价格昂贵 　合成培养基：DMEM、RPMI-1640 　　　优点：标准化生产、组分和含量固定、成本低 缺点：培养效果不好 目前常用的培养基 合成培养基：80%-95% 碳酸氢钠：2.0g 青、链霉素：各100万单位/毫升 血清：100ml 三蒸水：定容至1000ml 培养液的灭菌：蔡氏过滤器（0.22-0.45μm滤膜） 培养液的保存：4℃，30天 三 缓冲液的配制和灭菌 缓冲液：保持细胞存活，但不使其生长 NaCl: 8.0g KCl: 0.2g Na2HPO4·H2O: 1.56g KH2PO4: 0.2g 三蒸水：定容至1000ml 缓冲液的灭菌：高压消毒，加针头 星期五 一 细胞的选择 贴壁细胞：形状不规则，铺展开 悬浮细胞：球形 　培养液的选择：原细胞生存的培养液环境 二 细胞的复苏 　37℃迅速解冻：稀释DMSO 换液：去除死细胞 星期日 一 细胞的传代 贴壁型：0.25%胰酶消化液，吹打 悬浮型：分瓶 二 细胞的冻存 冻存液的配制：10%DMSO+90%培养液 冻存液的灭菌：过滤 冻存的细胞数：1*106个/ml，1ml 冻存的操作：离心后加培养基，缓慢冻存—4℃半小时、-20 ℃ 3-5小时、-80 ℃过夜、液氮1年 第二个星期三—细胞毒实验 一 细胞悬液的制备 贴壁型细胞-消化 悬浮型细胞-染色（胎盘蓝，苏丹红） 二 细胞悬液的计数 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 （细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×n×104 三 细胞悬液的稀释 合适的接种浓度（5*104—50*104个/ml） 四 种板：加入细胞悬100μl,每孔3000-10000个细胞 五 给药：给药体积25μl，计算浓度时注意稀释倍数 培养基、PBS缓冲液、三蒸水、助溶剂（损伤大） 悬浮型细胞：直接给药 贴壁型细胞：4小时后观察基本已贴壁后给药 第二个星期五—检测药物活性 MTT法原理： MTT噻唑蓝。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下 生成蓝色结晶，结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将 MTT还原）。还原生成的结晶可在DMSO中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。溶解多-颜色深-活细胞多-药效不好 MTT配制：5mg/ml,PBS，避光，用铝箔纸包好 MTT加入操作：25μl 贴壁型细胞-弃上清 悬浮型细胞-直接加 4小时后加DMSO操作：100μl 贴壁型细胞-弃上清，加后摇床上摇匀 悬浮型细胞-离心后吸出液体再加，摇匀 统计数据—酶标仪 抑制率= ×100% 使用细胞培养室须知 遵守《细胞培养室使用规则》 读懂《细胞培养从头学》 做好《细胞培养室预约登记》 填好《细胞培养室使用登记》 细胞培养理论阶段—到此 细胞培养实践阶段—任重而道远 希望在今后工作过程中，大家相互配合，努力营造干净