新型壳聚糖胶原微载体的制备和肝细胞培养.docVIP

新型壳聚糖/胶原微载体的制备和肝细胞培养 吴旭波，黄芳，吴薇，余松林，王加祥，匡洁，施敏敏，蔡劬，韩宝三，彭承宏 上海交通大学医学院附属瑞金医院器官移植中心，上海市消化外科研究所，上海市瑞金二路197号瑞金医院科教楼10楼1019室 200025 摘要：本文应用壳聚糖与胶原作为原材料，利用高压静电将两者混合液滴入三聚磷酸钠（TPP）溶液中交联固化形成微球（200um）,经真空冷冻干燥后制成微载体。应用壳聚糖/胶原微载体培养L-O2肝细胞，L-O2肝细胞在微载体上具有良好的貼覆性，壳聚糖/胶原微载体对肝细胞功能的发挥和维持十分有利。 关键词：壳聚糖；微载体；肝细胞；细胞培养 引言 体外肝细胞的高密度、高活性培养是“生物人工肝”系统的核心内容，微载体（microcarrier）培养肝细胞是近年来研究和应用较多的高密度悬浮培养肝细胞的理想方法之一，其较高的比表面积及面积/容积比可在有限的培养体积内黏附大量的肝细胞。微载体材料的生物相容性、与贴壁细胞的亲和性、微载体核心和表面的结构对细胞的生长和功能维持都有影响；具有良好生物相容性的生物可降解材料被认为是制备微载体的合适材料。壳聚糖（chitosan）是自然界中唯一带正电的天然生物材料，且具有良好的生物亲和粘附性，无毒、可降解、几乎无过敏性等优点，近年来被广泛应用于组织工程支架材料的制作；而胶原（collagen）更是体内细胞生长基质的重要成分，在体外有利于贴壁细胞的黏附。本文应用壳聚糖与胶原作为原材料，利用高压静电法一步制成微球，用于体外肝细胞培养。 1．材料 1.1 实验试剂 壳聚糖(Sigma)：低粘度（粘度﹤200mPa.s，脱乙酰度：75%～85%）；三聚磷酸盐(Sodium Tripolyphosphate，TPP；分子量：367.91，沪试）；含10％小牛血清DMEM培养液(GIBCO)；细胞消化液(含0.05％胰酶和0.02％EDTA的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)；吖啶橙（AO，Sigma）；永生化的正常人肝细胞系L-O2（本实验室）。 1.2 实验设备 高压静电微球发生仪(上海理工大学)；IX7型生物倒置显微镜(含荧光检测及照相系统)(Olympus)；真空冷冻干燥机（BENCHTOP）；扫描电镜（SEMHITACHI，复旦大学医学院）。 2．方法 2.1 鼠尾胶原的制备 取新鲜SD大鼠尾，生理盐水洗净后75%酒精浸泡消毒30min；将鼠尾剪成2～3cm的小段，再以75%酒精浸泡，30min后将鼠尾段剪开去掉皮毛，抽出银色的尾腱，称重。将鼠尾腱置于少许0.1％消过毒的乙酸溶液中，剪碎尾腱，再加入一定量的0.1％灭菌乙酸溶液（按每克尾腱加60ml 0.1%乙酸溶液的比例），4℃振荡 48小时；静置后取上层液体，4000转/分离心30min后，取上清，即得胶原蛋白溶液。胶原提纯：向上述胶原蛋白溶液中滴加0.1%NaOH液，至沉淀不再增加，1500转/分离心5min后见下层胶状物，弃上清，得到胶状胶原蛋白。可再加入0.1%乙酸溶液溶解胶原蛋白胶，根据加入乙酸液量的不同制备不同浓度的胶原。 2.2 壳聚糖/胶原微载体的制备和形态表征 以1%的乙酸液配制浓度为2%的壳聚糖溶液，等量的鼠尾胶原蛋白胶与0.1%乙酸溶液配制成胶原蛋白液；再将上述两种液体以1：1的比例制备成壳聚糖/胶原混合液。充分混匀后，利用高压静电微球发生仪将壳聚糖/胶原混合液滴入3%的酸性TPP溶液，形成壳聚糖/胶原微球。微球继续交联1小时后，双蒸水清洗三次，每次10分钟， -80℃冷冻。冷冻后的样品进行真空冷冻干燥，制成壳聚糖/胶原混合材料的微载体。 测定壳聚糖/胶原微载体的含水量和密度：取一定量的干微载体，称重W0，PBS液水化后滤纸吸去表面水份，称量湿性微载体的重量Wt，计算含水量的公式：含水量（Q）=(Wt–W0)/Wt×100%；根据湿性微载体的质量和体积，计算微载体密度ρ=m/v（m和v分别为湿性微载体的质量和体积)。重复3次实验，取其平均值。 2.3 壳聚糖/胶原微载体肝细胞培养 将壳聚糖/胶原微载体浸于PBS液中过夜水化；水化后的微载体以75%酒精浸泡消毒1小时，并移入灭菌培养皿中；PBS液清洗3次，每次15分钟，在以DMEM高糖细胞培养液清洗一次，时间30分钟；酒精消毒及PBS液清洗同时均放置于紫外灯下辐射消毒。最后微载体于DMEM高糖细胞培养液中浸泡过夜，备用。 取对数期生长的L-O2肝细胞5×105个与壳聚糖/胶原微载体10mg置于未经表面处理的塑料培养皿中（细胞不贴壁），在37℃，5% CO2条件下共培养，每30分钟振荡一次，每次5分钟，4小时后每小时振荡一次，8小时后静止培养；不同时间观察细