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PCR常见问题分析及解决方案 PCR技术的发明 1983 Kary Mullis 发明 1985 开始有文章发表 1993 获诺贝尔奖 广泛用于分子生物学研究领域 pcr动画.exe PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP 耐热聚合酶 ddH2O 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 浓度适当 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH、盐离子、稳定剂、增强剂 提供缓冲环境 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当，避免反复冻融 ddH2O pH值适当，避免污染 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 （ PCR 实验的不同需求） 1 Taq酶——扩增效率最高 发现 1969年，美国黄石国家公园温泉 活性 5‘-3’ DNA聚合酶活性 强 5‘-3’ DNA外切酶活性 弱 荧光探针（定量PCR方法） 3‘-5’ DNA外切酶活性 无 错配率每个循环约1/6000 3‘末端加“A” 能 产物可直接进行“TA”克隆 生产质检 诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。 无核酸酶和 细菌DNA污染 能有效扩增人基因组单拷贝基因 室温放置一周，无明显活性改变。 2 pfu酶——保真度高 原理 具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。 效率相对较低 3‘末端不加“A”，加A后才可进行TA克隆。 3 HotStart Taq酶——特异性高 热启动Taq酶 4 混合酶——高扩增效率＋高保真度 Taq plus Taq+pfu 用于复杂模板（GC rich, 二级结构）扩增 大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在6Kb以上时，可扩10-20kb。 Long Taq Taq+pfu 超长片断扩增，15-40kb. Taq platinum HotStart+pfu 高扩增效率＋高保真度 PCR MasterMix PCR Master Mix 产品特点 PCR常见问题分析 PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增或拖尾 假阳性 问题1：无扩增产物 无扩增产物之模板原因 无扩增产物之引物原因 无扩增产物之PCR条件原因 问题3：假阳性 提高PCR特异性的策略 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度 通常选择热启动Taq酶 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一 策略之四 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等 可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当 RT-PCR简介 主要内容 RT-PCR原理 RT-PCR步骤 常见问题分析 两步法RT-PCR 一步法RT-PCR 两步法与一步法RT-PCR比较 RT-PCR主要用途 分析基因的转录水平 获取目的基因 合成cDNA探针 逆转录酶的选择 AMV： 禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃，最新版本可达60 ℃ （Bioflux公司）。 MMLV： Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37℃，最新版本42 ℃（赛百盛） Super RNaseH- Reverse Transcriptase MMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42℃。（Tiangen天根生化） RNase H的作用 水解RNA-DNA杂合链中的RNA Super RNaseH- Reverse Transcriptase RT-PCR引物的选择 随机引物： 适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20μl体系50-250μg。 Oligo(dT15-18)： 适用于具有PolyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20μl体系0.2-0.5μg。 特异性引物： 与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20μl体系1pmol。 提高RT-PCR灵敏度 分离高质量RNA 使用无RNaseH活性的逆转录酶 RT常见问题 PCR引物设计 引物的重要性 引物设计是PCR成功的关键。 PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提