生物《基因工程的基本操作程序》.pptVIP

* 基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 一、目的基因的获取 1、目的基因主要是指______________________ 编码蛋白质的结构基因 2、获取目的基因的常用方法 （1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工合成 (1)从基因文库中获取目的基因 什么是基因文库？ 什么是基因组文库？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 基因组文库与部分基因文库的关系 （2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR——聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。 PCR技术 原理： 前提： 原料 方式 PCR扩增仪 DNA复制 一段已知目的基因的核苷酸序列 ：以_____方式扩增， 即____（n为扩增循环的次数） 指数 2n 模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶 2、具体过程 过程 变性、退火、延伸三步曲 变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 变性 退火 延伸 （3） 人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA?? B、线粒体DNA C、总mRNA?? D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库 A C 二、基因表达载体的构建——核心 （1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。 （2）用___________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 （3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 1.过程: 质粒 目的基因 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 表达载体 同种 1.过程: 2、基因表达载体的作用 a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用 思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？ 不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等 3.基因表达载体的组成： 它们有什么作用？ a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因 位于基因的首端,是mRNA结合位点 位于基因的末端,终止转录 检测目的基因是否导入受体细胞 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 三、将目的基因导入受体细胞 1、将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法 特点: 能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上 转化过程: Ti质粒 目的基因 构建 表达载体 导入 植物细胞 插入 植物细胞染色DNA 表达 新性状 转入 农杆菌 （2）基因枪法 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。单子叶植物常用，但成本较高。 （3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。 2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序: 提纯含目的基因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程： Ca2+处理大肠杆菌 感受态细胞 表达载体与感受