Westernblot问题及解决办法.docVIP

问题 可能原因 验证或解决办法 转膜不充分 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol（甲醇 靶蛋白分子量小于10,000 选择小孔径的膜，缩短转移时间。 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值 可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5）pH值缓冲液如乙酸缓冲液。 甲醇浓度过高 过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。 转移时间不够 Thick gel 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。 背景高 膜没有完全均匀湿透 使用100% methanol（甲醇 增加洗液体积和洗涤次数。 阻断不充分 增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。 二抗浓度过高 降低二抗浓度。 检测过程中膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜现象。 曝光过度 缩短曝光时间。 抗体与阻断蛋白有交叉反应 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。 没有阳性条带 抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间。 酶失活 直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。