无Ca2%2b玻璃化液OPS法冷冻保存山羊体外成熟卵母细胞研究.pdfVIP

192 中国草食动物 2008年专辑 作为代谢信号的瘦素，可能还有除内分泌外的其他调节因素，例 毛羊，湖羊妊娠早期的瘦素水平在17天有一高峰，与孕酮水平变 如胎盘及代谢冈素。本研究发现湖羊瘦素水平显著高于新疆细 化具有一定的相关性，具体的调节机制有待进一步研究。 邸建勇1，周志军2，陈晓勇1，赵驻军1，秦杰1，杨佳栋1，张竟乾1，田树军h2 (1．河北农业大学动物科技学院，保定071001；2．河北农业大学国资处) 摘要：试验研究了玻璃化液1(30％EG)、玻璃化液2(27．5％EG+2．5 卵母细胞存活率、孤雌激活率、体外受精能力及胚胎发育能力的影响。结果表明：在玻璃化液1、2、3中暴露后，卵母细胞的 液暴露／冷冻保存体外受精，在卵裂率、桑椹胚率、囊胚丰方面，玻璃化液z的毒性组(55．2％、27．6％、5．2％)较对照组 o．01)。 关键词：无ca2+玻璃化液；冷冻保存；山羊体外成熟；卵母细胞 卵母细胞作为胚胎工程、核移植、转基因等技术研究的试验 无Ca2+的DPBS配制而成。 材料被广泛应用。卵母细胞冷冻保存不但可以使卵母细胞的供 裹1 预平衡液和玻璃化液的组成 ％ 给不受时间和空问的限制，而且对保护品种资源、促进体外胚胎 生产技术的商业化具有重要意义。1985年Rail等发明玻璃化 冷冻法(vitrification)，并首次冷冻小鼠胚胎成功。 DMSO和EG作为两种常用的渗透性保护剂．EG的优点是 毒性低、渗透性高，DMSO较EG毒性大而且渗透性相对较差， 但其形成玻璃态能力强。两种抗冻保护剂的联合应用可以形成 毒性较低，玻璃化态好的玻璃化液。高浓度的玻璃化液冷冻保 存卵母细胞过程中，几乎对细胞不造成物理性损伤，但对其毒性 1．1．3卵母细胞的采集及体外成熟培养从河北省唐县定点 增强。毒性作用之一是改变卵母细胞胞质内Ca”游离浓度，孤 屠宰场收集山羊卵巢，保存于30℃左右的盛有0．9％生理盐水 雌激活卵母细胞。玻璃化液中的Ca2+和DMSO。EG均可以使 的保温瓶中，1～4h内运回实验室。生理盐水洗涤3次后，用刀 卵母细胞胞质内Ca2+瞬时升高，孤雌激活卵母细胞，但在不含 片划破(切剖法)卵巢上直径2～6mm的卵泡，在放有采卵液的 Ca”的玻璃化液中的EG并不引起显著性的Ca”增加。而无论 培养皿洗涮几次，保证COCs(卵丘一卵母细胞复合体)冲洗下 玻璃化液中是否含Ca”，DMSO都会引起细胞内ca2+增加。 来，在实体显微镜下用口吸管挑选形态正常、胞质均匀、颗粒细 为了减小玻璃化液对卵母细胞的毒性．降低孤雌激活率，提 胞不少于3层的COCs移入100 高卵母细胞受精后的卵裂率和胚胎发育能力，本试验进行了无 C酽+玻璃化液冷冻保存山羊体外成熟卵母细胞的研究。 1材料和方法 上覆盖矿物油，在培养箱中预先平衡4h)，每个微滴放入COCs 1．1 材料 1．1．1 OPS臂的制备参考朱士恩等的方法进行制备，用自 培养22h。用口吸管吹打除去部分颗粒细胞，以卵母细胞周围 制的小酒精灯，明火加热0．25mL的塑料细管变软后拉成OPS保留2～3层颗粒细胞为宜。洗净后供冷冻试验用。 mm，待冷却 1．2 管。OPS管的内径为0．02～o．03mill，管壁为0．02 方法 cm。 后用刀片将其切断，得到两支OPS管，细端长度为2～3