DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因.pdfVIP

DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因1 王成 游自立 夏晴 熊涛 夏阳 尧德中 电子科技大学生命科学与技术学院 成都 (610054) E-mail: youzili@ 摘 要： 为了研究皮罗卡平(Pilocarpine)致痫大鼠海马神经细胞丢失，苔藓纤维出芽在癫 痫中的分子机制，以癫痫持续状态 7天大鼠海马为材料，应用 mRNA差异显示技术（DD-PCR） 筛选差异表达基因。结果发现 13 个差异表达基因，其中 7 个基因在 Pilocarpine 致痫组高 表达，6个基因在 Pilocarpine致痫组低表达。这些差异表达基因可能在癫痫发生中起重要 作用。 关键词：癫痫；海马；DD-PCR ；皮罗卡品 1. 引 言 癫痫为人类常见神经系统疾病，一般人群中的年患病率为 0.5-7‰[1,2]，其中颞叶癫痫为 最常见的一类[3] 。实验动物模型中，大鼠Pilocarpine癫痫模型在临床及病理特征均类似于人 类颞叶癫痫，是一种理想的颞叶癫痫模型[4] 。Pilocarpine致痫后，癫痫大鼠海马CA1 、CA3 区和齿状回神经纤维均发生苔藓样异常出芽以及神经元丢失[5,6]，这些病变对颞叶癫痫的产 生及发展起着至关重要的作用[7] 。但癫痫大鼠海马神经元丢失及神经纤维苔藓样出芽的分子 机制至今尚不清楚。本实验利用mRNA差异显示技术（DD-PCR ）对大鼠海马神经元丢失及 神经纤维苔藓样出芽的分子机制进行初步分析。 2. 材料与方法 2.1 实验动物分组及癫痫模型制作 健康雄性成年 SD 大鼠 16 只（由四川省医学科学院实验动物研究所提供），体重 180 －220g ，随机分组，对照组 6 只，实验组 10 只。实验组按 3meq/kg 腹腔注射氯化锂，20 小 时后以 30mg/kg 剂量腹腔注射盐酸皮罗卡品（Fluka 公司），对照组大鼠注射等量生理盐水。 实验组大鼠注射皮罗卡品约 15 分钟后出现癫痫持续状态（status epilepicus, SE ），在SE 60 分钟后按 4mg/kg 腹腔注射地西泮以中止癫痫持续状态。选取癫痫发作程度在 Racine Ⅳ级 以上者饲养7 天，7 天后断头处死剥离出海马，进行 RNA 提取。 2.2 RNA 提取 用Trizol (Molecular research center, inc)提取大鼠海马总RNA ，然后用RQ1 RNase-free DNase (Promega)去除总RNA 中的DNA 。紫外分光光度计测定总RNA 的浓度，其中各样品的 1 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20020614004 ）、国家自然科学基金（项目编 号）资助。 - 1 - OD260/OD280均大于 2.0 。 2.3 mRNA 差异显示 cDNA第一链的合成按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas)进 行，取 4μg总RNA与 2μg锚定引物 (分别为T15A, T15C 和 T15G)，用DEPC处理水补至 12μl， 70℃孵育 5 min 。然后分别加入4μl 5 ×反转录缓冲液、1μl RibolockTM Ribonulease inhibitor 和 TM 2μl 10mM dNTP ，37℃孵育 5 min后加入 1μl RevertAid M-MuLV reverse transcriptase ，42 ℃孵育 60 min 。最后70℃温浴 10 min以终止反应。 取 2μl 反转录产物进行 DD-PCR ，在25μl 体系中含有 2μl cDNA，2μM 3’锚定引物与 5’ 随机引物（序列见表 1），200 μM