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DNA序列测定的原理和方法 郭 鹏 2003.10.05 方法 双脱氧链终止法的测序原理 　双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)为循环测序反应的链终止剂。 BigDye Terminators BigDye Terminators由三部分组成：ddNTP+氢化荧光素供体染料+二氯罗丹明受体染料，其中，前两者通过核苷酸连接器链接，后两者则通过单分子能量转移连接器链接，每种标记染料的最大激发为氢化荧光素供体，而发射光谱则为二氯罗丹明受体（图2）。由于使用了四色荧光分别标记了四种ddNTPs，可按照四种不同荧光来分别识别A、T、G、C，因此，可在一个反应管中完成循环测序反应，并通过一个电泳道电泳即可完成测序任务。 BigDye Terminators的基本原理与测序步骤 循环测序反应（Cycle Sequencing Reactions） 简便、快速、结果准确可靠。 安全、无污染。 模板用量大大减少。单链DNA模板用量为50-100ng，双链DNA模板则为200-500ng，PCR产物为每100bp仅需2-5ng。 测序能力增强，测序长度大大提高。具有一次扫描可检测多种荧光的特点，测序速度可高达200bp/小时，此外，一个样品一次可测定800-1200个碱基，而同位素一次只能测定200-300个碱基。 影响DNA测序的因素 待测DNA模板质量 待测DNA模板的浓度与纯度，以及在循环测序反应中的终浓度是其测序成功与否的前提条件，也是最易出现问题的环节。 PCR产物及质粒DNA模板是最常见的科研用测序DNA模板。模板纯化后，一般可采用琼脂糖凝胶电泳或DNA定量仪对其浓度与纯度进行进一步的鉴定。琼脂糖凝胶电泳鉴定时，要求条带清晰、无杂带、无拖尾；此外，可根据DNA Marker进行粗略定量。DNA定量仪鉴定时，要求模板的纯度达到A260/A280在1.70~1.90，最好为1.80，因为当A260/A280＞1.90时，表明RNA含量过高，而A260/A280＜1.70，表明蛋白质含量过高，均会对结果造成影响。未达到上述要求的样品，均应立即纯化，以保证测序结果。 循环测序反应条件 引物设计 　　由于循环测序反应的特殊要求，普通PCR反应中可成功地特异、高效扩增目的DNA片段的PCR引物并不一定总是适合作为循环测序反应的引物。循环测序反应的引物应当具有适当的Tm值。由于BigDye Terminators试剂盒循环测序反应中的退火条件为50℃10sec，因此，一般要求引物的Tm值至少＞50℃，一般以52℃-58℃为宜，但不能＞65℃。对于Tm值的估计，可借助于一些引物设计软件，也可手工Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算， 富含GC模板 富含GC的模板，易产生发夹结构，无法完成循环测序反应。主要有以下解决办法： 在反应体系中加入5-10%（v/v）的DMSO（二甲基亚砜）； 改变循环条件—在循环之前先将DNA于96℃预变性，其时间长短视具体情况而定，同时，将循环的变性温度提高至98℃； 换用其它测序试剂盒，如dRhodamine Teriminators试剂盒等。 即使通过上述改变，某些模板仍可能无法测序，此时，应将其构建成较小的DNA片段克隆，以降低DNA模板GC含量。 Thank you * * 双脱氧链终止法 双脱氧链终止法（Sanger法）和化学降解法（Maxam-Gilbert法） 图1 脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较 图2. BigDye Terminators 核苷酸链 ddNTP dNTP 终止 延伸 原 理 ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 图3 循环测序反应原理示意图 循环测序反应产物的纯化 电泳与结果分析 循环测序 反应产物 沉淀 洗涤 除BigDye Terminators 测序仪氩离子 激光能量 氢化荧光素 供体染料 二氯罗丹明 受体染料 激光扫描镜头 计算机 计算机 *