分子生物学实验 考题.docVIP

考试科目：现代分子生物学大实验考试时间：120分钟 试卷总分100分 一、名词解释（本大题共5小题，每小题3分，总计15分）4、质粒5、BLAST（本大题共5小题，每小题3分，总计15分） 7、等电聚焦（IEF） 二、简答题（本大题共4小题，每小题10分，总计40分）如有一核苷酸序列A，未知其功能，请用至少一种方法对其进行初步地功能标示。 简述SDS凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理。 SDS是一种强阴离子型去污剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，强还原剂例如巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，通过加热使蛋白质解离。解离后的氨基酸侧链与SDS结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，在达到饱和的状态下，每克蛋白质约克结合1.4g SDS。 由于SDS带有大量负电荷，当它与蛋白质结合时，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构像的改变。（8分）蛋白质SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于长椭圆棒。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则随蛋白质相对分子质量的大小成正比的变化。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与蛋白质相对分子质量的相关。因此，SDS不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋白质的分子量。（10分） 列举RNA提取的最关键的3个实验步骤，并说明其技术要求及注意事项。如果经PCR反应后未获得目的长度片断或者特异性不强，从那几个方面调整PCR程序以获得特异性强的目的片断？三、论述题（本大题共3小题，每小题15分，总计45分） 请设计克隆某一目的基因的主要实验过程并说明涉及的关键技术的原理及注意事项。’及3’端序列，测序拼接成全长序列，再根据1）步的步骤获得该目的基因。（10分） 关键技术：①引物设计，利用碱基互补原理，注意引物Tm值、GC%含量、发夹结构、引物二聚体、错配等。②连接、转化，利用Taq酶反应加A的特性，与T载体可以互补，连接。转化，则是利用α互补显色反应原理，对阳性克隆进行筛选。注意连接时目的片段与载体的摩尔比为5：1-10：1,一般16度过夜连接，转化时注意感受态的制作和热激时间50s左右。③质粒DNA提取则利用碱裂解法原理抽提，注意提取时蛋白要去除充分，RNA要消化干净。④RACE原理，根据mRNA反转录时加入接头，利用GSP引物和接头引物将目的片段扩增出来。注意引物设计要长，Tm值要高。（15分） 请按照实验顺序写出Northern杂交的主要实验步骤并说明该步骤的注意事项。 试论述从原核表达质粒的构建到蛋白质诱导表达需要考虑的因素。 东北林业大学 2005－2006学年第二学期考试试题答案 年 月 日 第 2 页共 3 页 学院：生命科学学院 教研室（学科）主任： 第 3 页共 3 页 装 订 线