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显微镜成像清晰度的决定因素: 1.分辨率2.球差3.色差 1、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用显微镜所能分辨清楚最近的相邻两点间的距离来表示。 人眼及各类显微镜的分辨率 人眼分辨率： 0.20 mm 光学显微镜分辨率： 0.25 mm 共焦显微镜分辨率： 0.18 mm 电子显微镜分辨率： 0.20 nm 在显微镜基础上配置激光光源，扫描装置，共扼聚焦装置和检测系统而形成的新型显微镜。 利用共聚焦光路和激光扫描获得生物样品的显微断层图象，动态扫描记录、图像处理及三维立体构建、成份分析等软件。 激光共聚焦显微镜构成 共聚焦显微镜的特点 光源 共聚焦技术 点扫描技术 信号放大 电子图像 软件  共聚焦显微镜的应用 高清晰成像 半定量荧光强度分析 荧光探针表达量测定 分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用 高清晰成像 激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。 可以清晰的表现某些细微结构。 透射光扫描（DIC） 利用激光透射扫描成像，用特殊滤光片达到相差显微镜的效果，可获得清晰的具有立体感的图片 半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。 细胞中特异性荧光标记的蛋白在不同药物环境和不同培养时间条件下的表达差异。 荧光探针的特异性标记：即荧光强度与特异性标记蛋白的表达量成正相关。 随机选择细胞或区域，测定其荧光强度值，并进行统计分析。 半定量荧光强度分析 半定量荧光强度分析 荧光表达量测定 利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。 荧光表达量测定 分层扫描（切片扫描） 按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。 分层扫描（切片扫描） 当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。 分层扫描（切片扫描） 分层扫描（切片扫描） 分层扫描（切片扫描） 连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。 利用专用图象处理软件，还可以实现其他许多数据分析。 细胞“CT”片 动态观测 激光共聚焦显微镜的一大特点就是可以对活细胞进行连续扫描，实现实时动态观测。这样可记录细胞在外界某种条件的刺激下瞬时发生的变化。 常用的有检测细胞内游离Ca 离子变化、细胞内PH值变化，等等。 Ca离子动态检测 荧光染料：Fluo-3AM。 此染料可特异性标记细胞内游离Ca离子，胞外不标记。 Ca离子动态检测 多色荧光标记检测 普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道同时探测。 激光共聚焦显微镜的优势 在结构方面 激光做光源，光色纯，波长固定，成像效果好，分辨率高，图象清晰，荧光检测信噪比高 可实现分层扫描 可实现连续扫描，可动态记录变化 可多根激光管同时扫描，多色荧光同时成像 扫描速度快，对样品损伤小 激光共聚焦显微镜的优势 在应用方面 形态观察--高清晰成像 半定量--荧光强度分析 荧光探针表达量测定 定位研究--分层扫描 多种荧光标记同时检测 荧光标记物绝对定量分析 扩展应用---如，FRAP法、细胞切割、细胞筛选等 在效果方面更灵敏： 共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确： 不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。 应用领域 （三）药理学： 药物对细胞的作用及其动力学分析。 （四）生理学： 膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布及其动态分析。 （七）微生物学和寄生虫学： 细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）； （八）病理学研究及病理学临床诊断： 活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，宫颈上皮细胞涂片诊断 常用荧光探针介绍 细胞活性探针 细胞器探针 细胞骨架探针 核酸探针 细胞内离子探针 细胞活性探针 活细胞探针：吖叮橙（AO） 是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。 死细