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FFA 作用于脂肪细胞Toll-NF- κB 信号通路机制研究 FFA 作用于脂肪细胞Toll-NF- КB 信号通路机制研究 摘 要 目的： 肥胖患者脂肪组织增加后更趋向于代谢分解,造成血浆游离脂肪酸( FFA) 水平增高 和细胞内脂质积聚，肥胖被认为是一种慢性炎症状态。本研究首先培养 3T3-L1 前脂肪 细胞并将其诱导分化为成熟脂肪细胞，用一定浓度游离脂肪酸（FFA）刺激脂肪细胞， 检测FFA 是否影响TLR4 的表达以及进一步能否介导NF- κB 信号通路，最终出现炎症因 子分泌增强。 方法： 3T3-L1 前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞(油红O 染色鉴定)。用脂多糖（LPS） 作为阳性对照，用ω-3 多不饱和脂肪酸(EPA)作为阴性对照，FFA 为实验组作用于成熟 脂肪细胞，收集细胞用Real-time PCR 检测各组TLR4 mRNA 表达水平；收集细胞全蛋白 用Western Blot 检测各组TLR4 和NF- κB 蛋白表达水平；抽提核蛋白用EMSA 检测各组 NF- κB 的活性；收集细胞培养上清液用ELISA 检测各组TNF- α, IL-6, MCP-1 等细胞因 子的表达，并用SPSS13．0 统计学软件分析。综合判断FFA 是否影响LR4 的表达以及FFA 能否通过TLR4 介导NF- κB 炎症信号通路。 结果： 1.本研究通将3T3-L1 前脂肪细胞诱导成脂肪细胞用于实验。3T3-L1 是国际上公认 的研究脂肪细胞分化的细胞模型，实验人员熟练掌握了诱导方法，可保证稳定的细胞诱 导成熟率。 2.通过Real-time PCR 方法从mRNA 水平检测TLR4 的表达情况，得出结果为：FFA 的mRNA 相对量为2.1，EPA 的mRNA 相对量为1.2，LPS 的mRNA 相对量为2.7，空白组的 mRNA 相对量为1。一定游离脂肪酸的刺激下可使脂肪细胞TLR4 的mRNA 表达量低于阳相 对照组，高于阴性对照组和空白对照组。 3. 用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对 照，通过Western-blot检测TLR4的蛋白水平表达情况，脂肪细胞TLR4的蛋白表达量低于 阳相对照组，高于阴性对照组和空白对照组。 4.用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对 照，通过Western-blot从蛋白水平检测NF- κB的表达情况。得出结果为：一定游离脂肪 酸的刺激下可使脂肪细胞NF- κB的蛋白表达量低于阳相对照组，高于阴性对照组和空白 对照组 4 FFA 作用于脂肪细胞Toll-NF- κB 信号通路机制研究 5.用一定浓度的FFA 刺激脂肪细胞，并分别用LPS 阳性对照、EPA 阴性对照和空白对 照，通过EMSA 方法从转录活性水平检测NF- κB 的转录活性情况。得出结果为：一定游 离脂肪酸的刺激下可使脂肪细胞NF- κB 有较强转录活性。 6. 用一定浓度的FFA刺激脂肪细胞，并分别用LPS阳性对照、EPA阴性对照和空白对 照，通过ELISA方法检测细胞培养上清液中IL-6、TNF-a、MCP-1的浓度及变化趋势。得 出结果为FFA组和LPS组MCP-1浓度较平行在2小时候浓度有明显上升，EPA组和空白对照 组MCP-1浓度较平行，FFA组MCP-1浓度与空白对照组MCP-1浓度比较在4h、6h、8h、10h、 12h均有差别（P0.05）。 7.各组间IL-6浓度趋势基本为LPSFFA空白对照EPA。FFA组IL-6浓度与空白对照 组在8h前无差别（P0.05），在第10h 时LPS组为224.03±18.96pg/mL，FFA组为199.13 ±3.55 pg/mL空白对照为171.83±6.47 pg/mL，EPA为126.20±4.35 pg/mL，FFA组与空 白对照组出现差别（P0.05）。 8.LPS组TNF-a浓度明显高于其他三组，EPA组和空白对照组TNF-a浓度较为接近。FFA 组TNF-a浓度与空白对照组浓度比较在4h、6h、8h、10h、12h均有差别（P0.05）。 结论： 1.用一定浓度的FFA 刺激脂肪细胞后，可使TLR4 从mRNA 水平和蛋白水平的表达增强。