寡核苷酸探针检测人工感染仔猪中PRRSV核酸分布地研究.pdfVIP

猪传染病 寡核苷酸探针检测人工感染仔猪中PRRSV核酸分布的研究 李雪梅”3，程安春★”， 汪铭书12 (1四川农业大学动物科技学院，四川雅安625014；2动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安625014；3 宜宾职业技术学院四川 宜宾644003) 摘要：根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC 设计一条37bp的寡核苷酸探，末端用生物素标记。该探针能特异性检测出PRRSV核酸。应用该探针对8头 人工感染PRRSV 果显示在感染后7天即可在肺脏，肺门淋巴结，胸腺，扁桃体，脾脏，肾脏，脑，肠检测到PRRSV核酸。 阳性杂交信号主要分布于扁桃体，肺门淋巴结，胸腺，脾脏，肾脏，大脑等，但是肺脏只是偶尔见阳性杂 交信号，心脏未见刚性杂交信号。该探针可用于PRRSV感染的诊断和组织中核酸的定位以及对存档病理组 织的回顾性研究。 关键词：原位杂交；寡核苷酸探针；PRRSV；检测 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine and ReproductiveRespiratory 年首先暴发于美国【l】，其后加拿大，继而荷兰，两班牙，比利时，英国，法国等养猪业发达的欧洲国家也 相继报道了本病。目前是肚界上养猪业危害最大的疾病之一。本病是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的猪繁 殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征。根据病毒基 因结构和抗原的不同分为欧洲型和美洲型12】。我国各地分离的PRRSV毒株是美洲株型，目前还未见有欧洲 型的报道。本病对全世界养猪业造成的经济损失严重，研究也较多，开展的实验室诊断方法多p“J，如病 毒的分离与鉴定，抗原及抗体的检测，分子生物学方法诊断等。但在国内朱见利用寡核苷酸探针原位检测 苷酸探针，对人工感染仔猪体内PRRSV核酸分布进行了研究。 。 1材料和方法 1．1材料 。 1．1．1 病毒PRRSV病毒为从四川分离的PRRSVSC．1株，序列分析属美洲魁；参考毒株流行性乙型脑炎 所有毒株由动物疫病与人类健康四川省重点实验窒保存。 1．1．2 病料来源 8头28日龄的仔猪，PRRSV抗体检测阴性，经滴鼻人工感染PRRSVSC—l株 心脏、肝脏、脾脏、肾脏、回肠、胸腺、肺门淋巴结等，每次2头。对照仔猪接种不含病毒的细胞培养物， 于接种后28天剖杀取同样组织。将组织保存一部分在液氮中，其余都用4％多聚甲醛吲定，常规石蜡包埋。 基硫酸钠)， NBT／BCIP(四唑氮蓝／5．溴一4一氯一3．吲哚一磷酸盐)等均购自成都天泰公司。 1．2方法 1．2．1探针乖引物的设计通过GenBank中已发表的美洲型ATCC A1T GACTGGCTG A]rAGGGGACAAGGTTTACCACTCCCTG丁盯AAC．3‘，生物素于5’末端标记， 核苷酸探针：5-GGC 由上海生物工程公司合成和标记，经敏感性及特异性检测符合要求后使用。 1．2．2探针特异性试验采用斑点杂交的方法来检测探针的特异性。分别将提取的PRRS病毒RNA、猪瘟 272 第六次全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 x 点样于经10 x x XSSC 预杂交2d,时，换入杂交液37℃杂交过夜，经含0．1％SDS的2SSC室温洗10min2次，0．1％SDS的0．2 X x x 室温洗10rain2tk，0．1％SDS的0．16SSC50℃洗15min rain，洗膜，，将膜置显色液中显 150mmol／LNaCI，pH7．5)封闭，与亲和素．碱性磷酸酶结合物37C作用40 色，最后以TE终止反应。 1．2．3