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花鲈胚胎干细胞培养及体外分化的研究 陈松林。，沙珍霞，叶寒青 (中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室， 山东青岛266071) 摘要胚胎干细胞(Es细胞)是研究细胞发育与分化的分子机理、建立基因打靶技术和制作定点突 基因打靶技术，我们以海水名贵养殖鱼类花鲈为材料，进行了胚胎干细胞分离、培养与体外分化的研究。 从lO多个花鲈囊胚细胞原代培养物中，成功地建立了1个胚胎干细胞系(Lateolabrax JaponicusEmbryonic StemCellIDESl的)。该细胞能在体外稳定生长和增殖，目前已培养至100多代。形态观察表明UEsl细胞 呈小的圆形、多角形或多边形，具有较大的细胞核；组织化学染色表明LIKSl细胞具有强的碱性磷酸酶活 性；染色体分析表明LJESl细胞具有正常的二倍体核型。研究了不同因子对鲈鱼胚胎干细胞生长和增殖 的影响。在适当条件下，LJESI细胞可分化形成黑色素细胞、神经细胞、肌肉细胞及拟胚体等不同类型细 胞，显示其具有发育多能性。 关键词鲈；胚胎干细胞；核型；体外分化 胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎中分离培养出的一种未分化的多能性细胞，这种细胞一方面具有发育的全能 性，另一方面可在体外经受各种遗传操作，因而是连接动物体内和体外遗传操作的桥梁。基因打靶是分析基因功能、制作定 术主要包括四大步骤：(1)胚胎干细胞系的建立；(2)靶标基因的克隆及同源重组载体的构建；(3)同源重组载体向胚胎干细胞 的定点转移；(4)定点突变干细胞向动物囊胚的移植。鉴于胚胎干细胞和基因打靶技术在发育生物学和功能基因组的基础研 究以及人类疾病防治和定点突变转(缺)基因动物制作等方面所具有的重要科学意义和应用价值，这一技术已成为当代生命 学、发育生物学和基因功能分析的研究中发挥了巨大作用。随后，国外相继培养出大鼠、鸡、兔、猪、猴和人的胚胎干细 胞C2-sJ。而有关养殖鱼类胚胎干细胞培养和基因打靶的研究，目前则少有报道。 花鲈是我国特有的鱼类品种，也是我国海水养殖业的支柱鱼种，其肉味鲜美，不仅深受国内消费者欢迎，而且也是我国的 主要出口鱼种之一，其养殖潜力巨大。但是，病害是制约花鲈大规模养殖的瓶颈因子。探索胚胎于细胞介导的外源基因定点 整合新途径，培养抗病力强、生长快的海水养殖新品种，对于我国海水养殖业的可持续发展具有重要意义和应用价值。为建 立海水鱼类基因打靶技术，并开展鱼类胚胎细胞分化与发育的分子调控机理的研究，我们以花鲈为材料，进行了胚胎干细胞 et 分离、培养及体外分化的研究。成功地建立了花鲈胚胎干细胞系(then 该细胞系的形态特征、碱性磷酸酶活性、染色体核型，细胞生长和增殖，特别是体外诱导分化进行了研究。 1材料与方法 1．1培养基配制 参考小鼠KS细胞培养基配方[7J，结合鱼类细胞的特点，制备花鲈胚胎干细胞培养基。有关培养基组成及培养方法按已 基金项目：国家自然科学基金；国家高技术研究发展计划(863计划)(2002AA629180) * 通讯作者：Email：chensl@州．ac．cn。 陈松林，男，博士，研究员，博士生导师。研究方向：海洋生物技术。 ·1016· 第一届海洋生物高技术论坛论文集 报道的进行[6J。 1．2碱性磷酸酶染色 碱性磷酸酶活性是鉴定胚胎干细胞多能性和未分化状态的重要指标之一[8J。本研究采用碱性磷酸酶染色法鉴定花鲈胚 胎干细胞的发育多能性和未分化状态。简言之，培养中的细胞用PBS清洗后，固定于1％戊二醛中10rain，用PBS清洗后再用 BCIP／NBT作为底物染色，检测碱性磷酸酶的活性。 1．3不同因子对花鲈胚胎干细胞增殖的影响 X d后换一次培养基，4—5d后，胰 将LJE