Lewis+y抗原对人卵巢癌细胞RMG-I-H部分耐药相关蛋白基因表达影响.pdfVIP

·中文论著摘要· Lewis Y抗原对人卵巢癌细胞RMG．I．H部分耐药相关 蛋白基因表达的影响 刖 吾 卵巢癌的死亡率在女性生殖器肿瘤中最高，主要是由于缺乏有效的早期诊断 方法以及化学药物治疗中肿瘤耐药性的产生。70％的卵巢癌患者在术后2年内复 发，其发生的重要原因是卵巢癌细胞的耐药。因此，耐药的分子机制的研究对卵 巢癌的临床疗效的改善及患者的生存率的提高意义重大。 卵巢癌细胞耐药的产生涉及到多种机制，近来，细胞的聚糖及糖基化的变化 与耐药之间的关系引起人们的关注。Lewis y抗原是细胞膜上的双岩藻糖基化寡聚 基因转染后的人卵巢癌细胞系RMG—I-H与转染前的细胞系RMG．I相比，出现了癌 相关抗原Lewis y的高表达。进一步的实验证明，RMG．I．H在增殖，侵袭等恶性细 胞生物学能力增加的同时，其对卵巢癌化疗中的常用药物卡铂、5．氟尿嘧啶及紫 杉醇的耐药性也有所提高。因此，本次实验通过检i911Jal，2脏因转染前后的人卵 巢癌细胞系RMG．I和RMG．I．H及Lewis Y单克隆抗体处理前后细胞系RMG．I．H部分 resistance 耐药相关蛋白基因：多药耐药基因．1(multidrug1，MDR—J)，多药耐药相 resistance—associated 关蛋白一1(multidmg resistanceassociated kinase -2(multidmg C-a，PKC-a)及拓扑异构酶I(topoismeraseI，Topo，)的表达差异，探讨LewisY 抗原与耐药相关蛋白基因的表达调节的相关性，为研究Lewis y抗原在人上皮性卵 巢癌耐药机制中的作用奠定基础。 材料和方法 一、卵巢癌细胞株 pcDNA3．1(-)-HFUT-H(含J，2胛基因)获得的LewisY高表达细胞系。 二、Rrr-PCR min min，冰上冷却2 各取4陷总RNA反转录合成cDNA，反应条件为70℃10 min，70℃15 以上，42℃60 min。取逆转录产物行PCR扩增，反应条件为：94℃ 3min后，以适当的循环数进行以下反应：94℃40s；退火温度1min；72℃1min， 最后为72℃7min。PCR产物在3．0％琼脂糖凝胶中进行电泳后，经电泳凝胶成象 分析仪拍照并分析处理。以各自内参照13-aetin表达量为基准计算各条带的相对含 量，进行基因表达水平的半定量分析。实验重复进行3次。 三、免疫细胞化学方法 到预先放置7minx22 I衄)中，置C02孵箱培养2d，待细 nlnl盖玻片的培养1111(35 胞接近长成单层，取出盖玻片，浸入PBS洗2次，4％多聚甲醛固定，染色方法按 SP试剂盒说明书进行。一抗兔抗人P．gp多克隆抗体1：100稀释。在40倍镜下观 察，以细胞浆、细胞膜有棕黄色颗粒着色为阳性。实验重复三次。图像分析软件 Meta Morph分析结果。 四、裸鼠皮下移植瘤建立 取RMG．I．H及RMG．I细胞制成单细胞悬液，记数活细胞数，调整细胞密度 组，于背部皮下注射细胞悬液0．3脚。裸鼠在SPF条件下饲养，定期观察小鼠精 神、饮食及排便情况。五周后处死全部裸鼠，取出皮下瘤块，分离，制备成石腊 块。 五、免疫组化染色方法 上述裸鼠皮下移植瘤经病理证实为低分化卵巢透明细胞癌。裸鼠皮下移植瘤 石蜡块连续切片，厚度为4