抗口蹄疫转基因山羊抑制羊口蹄疫病毒复制地研究.pdfVIP

…簇鬻麟。鬻懿。黪壤鬃蒸黧嵩黧藏嘲豢缫羹渗麟j。藏黼凰黼瓣．瀵淄羹麓赫黼鬻鬻雾麟 震壤簿t攀。i瓣麓瀵糕麟瓣黼纛滋添熬懑朦■黑嚆誓豳黧麟雾黧黧 抗口蹄疫转基因山羊抑制羊口蹄疫病毒复制的研究 李文婷，康诗梦，韩红兵，连正兴 中国农业大学动物科技学院，北京，100193 关键词：山羊；RNA干扰；转基因；口蹄疫病毒 引言 andMouth 15蹄疫(Foot Disease，FMD)是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄目动 物，因其感染性极强，传播速度快，造成的经济损失巨大，被国际兽疫局列为A类传染病，该疾病主要是 andMouthDisease 由口蹄疫病毒(Foot Virus，FMDV)引起的。口蹄疫病毒属于小IⅢA病毒科，口蹄疫病 毒属，其基因组全长8500nt旦较容易变异，至今发现的口蹄疫病毒有7种血清型及65种亚型，研究发现各血 清型间不存在交叉免疫保护作用，正因如此，疫苗研发的滞后性导致口蹄疫防治出现难题。所以我们针对 口蹄疫病毒基因组保守区3D，使用RNAi技术与转基因技术相结合，培育出抗口蹄疫转基因羊新品种。 材料与方法 本实验采用双荧光素酶报告系统筛选出针对口蹄疫病毒3D序列的抑制效率较高的shRNA，随后，通 合，RNA水平通过NorthernBlot及绝对定量PCR对表达出的siRNA进行了定性及定量的分析。接下来，选用 口蹄疫病毒的易感细胞——上皮细胞作为研究对象，原代培养转基因阳性个体舌上皮细胞和皮肤上皮细 疫病毒的感染。模拟物证实有效之后，利用舌上皮细胞进行了细胞水平的攻毒实验。 结果与讨论 本实验筛选出了针对口蹄疫病毒3D序列的shRNA，双荧光素酶报告系统检测出抑制效率高达 选和Southem Blot鉴定得到7只转基因阳性个体，又通过Northern 性分析及定量检测，结果显示两只转基因个体每1蚌g．营,RNAqh分别表达3×101 05pM和3×10227pM的siRNAs， 证实制备的转基因山羊上皮细胞能够稳定表达干扰口蹄疫病毒3D序列的siRNA，且表达量存在差异。 接下来，原代培养转基因阳性个体舌上皮细胞和皮肤上皮细胞，采用细胞原位杂交，证实皮肤上皮细 外源特异性siRNA的作用，证明抗口蹄疫转基因山羊细胞可以针对口蹄疫基因组3D序列发挥稳定且有效的 RNAi作用。 最后，分别采用10TCID50、100TCID50、1000TCIDS0 FMDV-O型病毒对舌上皮细胞进行细胞攻毒实 验，收取接毒细胞上清液并测定病毒滴度。结果显示在三个滴度病毒作用下，转基因组上清液的滴度均显 著低于非转基因组，证实转基因山羊细胞可以抑制口蹄疫病毒基因组的复制。 致谢 本研究受转基因生物新品种培育科技重大专项资助(2011ZX08008．005) 140