生化实验报告 胰蛋白酶活力测定.docVIP

胰蛋白酶活力测定 一、实验原理 1、福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。 2、蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。 二、实验仪器 1、试管 2、7220分光光度计 3、恒温水浴锅 三、实验试剂 1、福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 2、0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 3、10%三氯乙酸溶液 4、0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 5、0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再加少量0. 2mol/L磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。 6、500ug/L酪氨酸溶液 7、胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤 1、标准曲线的制作：按下表加入试剂： 管号 1 2 3 4 5 6 500ug//酪氨酸溶液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 各管中加0.5%酪素2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，过滤除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸钠5ml，再加入福林试剂1ml，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD680。 以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。 2、样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂 管号 7 备注 0.5%酪素溶液 2.0 37水浴中酶解15分钟 2mg/ml胰酶溶液 1.0 10%三氯乙酸溶液 3.0 过滤 上清液 1 37水浴中显色15分钟 0.55mol/L碳酸钠溶液 5.0 福林试剂B 1 OD680 ? ? 酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。 样品中含酶活力单位=A/15 ╳F A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F—酶液稀释倍数 五、实验结果 管号 1 2 3 4 5 6 7（样品） 酪氨酸微克数 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ----------- OD680 0 0.157 0.258 0.379 0.499 0.585 0.993 OD680 0 0.156 0.259 0.379 0.496 0.585 0.993 OD680 0 0.157 0.258 0.378 0.497 0.585 0.994 OD680(平均) 0 0.157 0.258 0.379 0.497 0.585 0.993 由上表可作出标准曲线如下： 由上可知，样品的吸光度y=0.993，则x=0.8μg，即A=0.8μg 故根据公式样品中含酶活力单位=A/15 ╳F A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F—酶液稀释倍数 胰蛋白酶活力为：0.8 /15 ╳13=0.69 六、实验分析 1. 测定胰蛋白酶活力的原理? 答：蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。 2. 胰蛋白酶的最适PH值多少? PH值对胰蛋白酶稳定性有何影响? 答：胰蛋白酶的最适PH值为8.1