1分子生物学常用技术4——DNA 测序和基因芯片.pptVIP

2): siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在siRNA中反义链互补结合的两端切割mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。 siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA， 可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。  3. RNAi 的作用特点 (1)“共抑制”: RNAi 使外源基因同源的内源基因沉默 (3) 特异高: RNAi能特异性降解mRNA单个碱基的改变即可使RNAi失效。 (4)穿透能力强: RNAi能在不同的细胞间长距离传递 (2)效率高: 效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率高 100fold, 使靶基因表达降到很低水平甚至完全“剔除” (knockdown) 。它比基因敲除技术(knockout)更为便捷, (5) 稳定性高:此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性; RNAi具有一定的可遗传性。 4. RNAi技术的基本程序 ⑴ 确定干涉靶点 干涉靶点应具备三个条件（特异性、避免调控区、AATT/TT 特征 GC：50%）。 ⑵ si RNA设计：3’需有UU单链或用dTdT代替。 ① 化学合成方法合成双链si RNA； ② 利用PCR扩增和体内转录法制备发夹双链 si RNA。 5. RNAi 操作方法 2). siRNA表达载体: 构建特定的siRNA表达载体，在体内表达siRNA而引发基因沉默。此法排除了RNA酶干扰，延长siRNA半衰期; 更重要的是，该法可以进行稳定表达细胞株的筛选，且随着载体复制扩散到整个机体，基因抑制效果可传代。 1). 直接导入: 将靶向特定基因的大约21个碱基长短siRNA，或45个~50个碱基的发夹结构RNA（small hairpin RNA，shRNA）导入到细胞，shRNA在细胞中会自动被加工成siRNA，从而引发基因沉默或表达抑制. 6. RNAi 的应用 基因功能研究 抗肿瘤治疗 抗病毒治疗 转基因研究 干细胞研究 研究信号传导的新途径 常见病的治疗 药物筛选探索 基因治疗 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2008 for his discovery of human papilloma viruses causing cervical cancer for their discovery of human immunodeficiency virus Harald zur Hausen Fran?oise Barré-Sinoussi Luc Montagnier 1/2 of the prize 1/4 of the prize 1/4 of the prize Germany France France German Cancer Research Centre Heidelberg, Germany Regulation of Retroviral Infections Unit, Virology Department, Institut Pasteur Paris, France World Foundation for AIDS Research and Prevention Paris, France b. 1936 b. 1947 b. 1932 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2009 for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase Elizabeth H. Blackburn Carol W. Greider Jack W. Szostak 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the priz