SSH文库和表达序列标签技术在蔬菜研究中的进展.pdfVIP

SSH文库与表达序列标签技术在蔬菜研究中的进展 韩旭张俊华崔崇士‘ (东北农业大学园艺学院，哈尔滨，150030) 摘要：本文综述了SSH文库和表达序列标签(EST)技术的基本原理，并介绍了该技 术近年来在蔬菜领域里的研究进展，对在南瓜抗疫病应用前景进行展望。 关键词：SSH文库；EST；南瓜疫病 蔬菜作物的生长、发育、开花、结果、衰老和死亡等生命过程伴随着复杂 的生理生化变化，是作物体内基因在时间和空间上有序表达和调控的结果。分 离差异表达基因对于抗病基因鉴定、克隆、转基因以及南瓜抗疫病分子辅助育 种奠定理论基础。 一、抑制性差减杂交技术(ssH)及其研究进展 从20世纪70年代开始，由于限制性内切酶的发现以及质粒等载体的应用， 推动了DNA体外重组的进展，cDNA文库构建是基因克隆和分离的重要方法之 一。近几年来在植物的研究中也应用的较多。 1．SSH技术的基本原理 抑制差减杂交(SSH)技术是一种比较和分离不同细胞系、不同组织间或同一 细胞系、同一组织在不同条件下差别表达基因的方法。其基本原理是以抑制 PCR(suppressionPCR)为基础的DNA差减杂交方法，所谓抑制PCR是利用 非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅．柄”结构，无法与引 物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增，同时，该方法运用了杂交二级 动力学原理，即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度 低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的cDNA相对含量达到基本一 致。 2．SSH技术分离诱导型表达的抗性相关基因 植物的抗性育种一直是育种工作的重要方面，分离抗性相关基因，了解和 揭示植物抗性的分子机理，从而进行转基因育种，无疑是快速培育植物抗性新 品种的捷径。目前，SSH技术己被成功应用到植物抗性相关基因的分离中。生 物胁迫(水分、干旱、盐、热、冷、辐射、离子毒害等等)与非生物胁迫(细菌、 真菌、虫害等等)因素会在抑制某些基因表达的同时诱导另一些基因的表达，从 而使植物体发生生理生化和外部形态的变化，表现出对外界胁迫的抗性。植物 抗性的产生涉及到新陈代谢，蛋白质的分解和合成，细胞膨压的维持和细胞发 育，叶绿素合成及光合作用，信号转导等等多个方而，是由多基因控制的性状， 仅仅克隆某个或某一类基因远远不能揭示植物抗性的分子机理，而利用SSH技 术一次可分离上千个差异表达的基因，因此该技术是分离植物抗性相关基因， 87 揭示植物抗性分子机理的有力手段。应用SSH技术，将胁迫条件下的植物材料 文库；通过筛选，己经获得了一些与抗性相关的差异表达基因。在通过SSH技 术分离差异表达基因的过程中还分离到了许多未知基因，如张岩等获得的热抗 性相关基因中有33％为未知基因(Zhang 有关的EST s中有67．9％为未知基因，这些新基因的发现对于深入全面的揭示 生命现象具有重要意义。 3．SSH技术对次生代谢物合成相关的特异表达基因的分离 植物的次生代谢物质是大自然长期进化的结果，是植物生态适应的重要手 段。如各种植保素、木质素是植物产生抗逆反应的重要物质基础；生物碱、生 氰苷等是植物防御动物的有效武器；类黄酮中的花色苷、甜菜色素和番茄红素 等赋予植物花和果多彩的颜色，对物种的繁衍起着重要的作用。 植物的次生代谢物质的产生是植物发育过程中特异基因表达和调控的结 果。分离控制次生代谢物质合成的相关基因是人为调节和控制植物次生代谢， 控制植物的生长发育、改良植物品质、增加产量的前提条件。日前，SSH技术 己开始应用于次生代谢物合成相关基因的分离，但研究报道还较少。通过选取 不同生长时期、不同部位或不同处理的植物材料建立抑制性差减文库，己经分 离到了部分调控次生代谢物质合成的特异表达基因，初步揭示了部分次生代谢 物质合成的分子机理。 二、EST研究进展 1．EST技术的概念 成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对 其5’或3’端进行一步法测序，所获序列与基因数据库己知序列比较，从而获 得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识 的技术。EST是基因的“窗口”，可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基 因，故被称之为“表达序列标记”。 2．EST技术在分离和鉴定新基因中的应用 传统的基因克隆方法是通过差减杂交、