刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因的生物信息学分析、克隆表达与免疫保护性研究.pdfVIP

刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因的生物信息学 分析、克隆表达及免疫保护性研究 杨燕萍1’2，刘转转2，王海龙1，李雅清1，祝建疆1，刘宜升p，殷国荣卜 1．山西医科大学医学寄生虫学研究所，太原030001； 004 2．徐州医学院病原生物学与免疫学教研室，江苏徐州22l 【摘要】目的对刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因进行生物信息学分析，并对该基因 进行克隆和表达，纯化表达产物，分析其免疫原性；观察重组弓形虫苹果酸脱氢酶蛋白(rTgMDH) 免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染作用，探讨rTgMDH作为弓形虫疫苗候选抗 原的可能性。方法(1)对TgMDH基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分 Bcepred等生物信息学在线分析程序，结合Gene 测TgMDH蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性、可塑性跨膜区翻译后修饰位点、亲(疏)水性、 二级结构、抗原表位，通过SMSS—MODLE软件预测该蛋白的三维结构。(2)构建重组质粒 原性分析。收集、纯化Im株弓形虫速殖子，提总RNA；设计合成引物并引入＆o尺I和励DI酶切 blot分 以镍离子亲和层析柱对大量表达的rTgMDH进行纯化，用小鼠、兔抗弓形虫血清做westem 析其免疫原性。(3)观察不同剂量rTgMDH滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答。分别用10嵋、 20“g、30“g、40“g 清，采集小肠、鼻咽和膀胱冲洗液。ELIsA法测定测定上述3种冲洗液及血清中抗rTgMDHIgA和 PBs中滴鼻免疫小鼠3次，对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，分别用1×104速殖子／ 20“1 只感染小鼠和4×104速殖子／只灌胃感染小鼠，观察慢性感染和急性感染时小鼠的健康及存活状况。 攻击感染后一个月，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子数。结果(1)生物信息学分析发现，刚地弓 形虫MDH有9个表面可及性参数兰1．9的区域、4个亲水性参数≥1．9的区域、7个柔韧性参数22的 区域、14个翻译后修饰位点、14个潜在抗原表位，可能具有免疫原性。(2)以RH株弓形虫速殖子 的cDNA为模板，扩增获得95 westem 滴鼻免疫小鼠，均不同程度诱导了小鼠特异性免疫应答。免疫组小鼠血清、鼻咽冲洗液、膀胱冲洗 【基金项目】国家自然科学基金项目(No 141 尤以30岭、40岭组显著。免疫组小肠冲洗液IgG水平高于对照组，组间差别无统计学意义。小鼠脾 淋巴细胞培养上清细胞因子检测结果：小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果示rTgMDH刺激指数高于对照 尸≮0．05)，30嵋组可以更有效地诱导黏膜和系统免疫应答。(4)以不同剂量弓形虫速殖子攻击感染 30嵋rTgMDH滴鼻免疫小鼠。感染后第7天，小鼠竖毛、倦怠、活动减少、饮水及采食减少。在急 性感染鼠，免疫组的存活率为52．38％，对照组存活率为31．82％，而慢性感染小鼠则全部存活。免疫 生物信息学分析发现刚地弓形虫MDH有14个潜在的抗原表位，可能具有免疫原性。(2)成功构建 免疫抗原性。(3)作为弓形虫疫苗的候选抗原，30岭组rTgMDH滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统 免疫应答。 【关键词】刚地弓形虫；生物信息学；苹果酸脱氢酶；原核表达；滴鼻免疫 【作者简介】杨燕萍，女，在读硕士研究生，研究方向为感染与免疫。 142