实验四氨基酸的纸层析法.docVIP

姓名：郭沈杰 年级专业：2012级生物科学 同组者：蔡萍萍 学号：12050011012 实验四 氨基酸的纸层析法 一、实验目的 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。 二、实验原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时，水为固定相，它与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 氨基酸无色，利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。 本实验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、苯丙氨酸。 三、实验仪器 1、?新华滤纸 2、?层析缸 3、?细线 4、?点样管 5、?橡皮筋 6、?电吹风 7、?喷雾器 8、铅笔 9、直尺 四、实验试剂 1、精氨酸、 苯丙氨酸、 混合氨基酸（精氨酸、苯丙氨酸） 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，在上面相同间隔画3圆点（原圈直径约5mm）。 2、取毛细管3支，分别吸取精氨酸、苯丙氨酸、氨基酸混合液少许，在原圈处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。 4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。 7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。（书上图谱横着看） 六、实验结果 实验数据 组数 谷氨酸 苯丙氨酸 混合氨基酸 原点到溶剂前沿的距离（cm） 7.90 7.90 7.90 原点到层析点中心的距离（cm） 1.35 4.55 4.55 1.35 Rf 0.1709 0.5759 0.5759 0.1709 与表中标准氨基酸Rf值比较，可知混合氨基酸是1：1混合的谷氨酸和苯丙氨酸的混合物。 原始数据 七、实验分析 1、纸层析法是利用各种氨基酸在两相中不断进行分配，分离系数不同，导致氨基酸随流动相的速率不同，在滤纸上相互分离形成距原点不等的层析点，而且在一定条件下，不同的氨基酸有固定的移动速率的原理。由于分离时间，室温等条件的限制，分离会出现误差，可以通过计算相对的Rf 值,减少实验误差。 2、根据各个氨基酸的Rf值，知道要分离的氨基酸是否能被分开，分的有多开。 就是说如果知道每个氨基酸的Rf值，没做实验，基本上就知道各个氨基酸在纸层析后的相对位置，及氨基酸谱带。 纸上分配层析所出现的拖尾现象在点样品后，样品点吹的太干燥所 Rf的影响因素： 室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等 注意事项： 1）样点直径不宜超过5mm，且应边吹边点。 2）点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层。 3）喷茚三酮—无水丙酮液时要均匀，注意使溶液不倒流，不间断。 4）观察层析点时要多等一段时间，使得显色点更清楚，更有利于几何中心的确定。 5）操作时要带手套,一定不要直接用手接触滤纸已层析过的部分。因为手上的油脂汗液等会影响展层剂，影响氨基酸的溶解度 中国海洋大学试验报告 2013年11月13日