CTAB配方及植物DNA提取方法.docVIP

主要试剂的配制 参考（美）萨姆布鲁克（Sambrook，J.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]： （1）0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0)：称取EDTA-Na2 18.61 g，加80 mL双蒸水，磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL，在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。 （2）5 mol/L NaCl溶液：称取NaCl 29.22 g，溶解于90 mL的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100 mL，在高压灭菌20 min。 （3）10 mol/L NaOH溶液：称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水，搅拌，定容到100 mL。 （4）1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0)：称取12.114 gTris碱，溶于80 mL的双蒸水，加入浓HC1 4.2 mL，调整PH值到8.0，加水定容到100 mL，高压灭菌20min。 （5）10%CTAB（m/v）：称取CTAB 10.00 g，溶解于80 mL的双蒸水，加热促进溶解，加双蒸水定容到100 mL，室温保存。 （6）5 mo1/L KAc溶液(pH 4.8和6.5)：分别称取KAc晶体49.07 g，溶于80 mL的双蒸水，再用冰乙酸调至pH 4.8和6.5，加双蒸水定容到100 mL，在1.03× 105Pa下灭菌20 min。4℃保存。 （7）3 mo1/L NaAc·3H2O溶液(pH 5.2)：称取NaAc晶体20.412 g溶解于约30 mL的双蒸水，用冰乙酸调至pH 5.2，加双蒸水定容到50 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。 （8）提取缓冲液（0.4 mol/L葡萄糖，3%PVP，2％β-巯基乙醇）250 mL：称取葡萄糖19.817 g、PVP 7.50 g，加水溶解并定容到250 mL，在1.03×105Pa下灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。4℃保存。 （9）裂解缓冲液（3%CTAB；100 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0；20 mmo1/LEDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2％β-巯基乙醇）100 mL： 取10%CTAB 30 mL，加1mol/LTris～HC1(pH 8.0)10 mL，加0.5 mo1/L EDTA(pH8.0)4 mL，加5 mol/LNaCl 28 mL并定容到100 mL，高压灭菌20 min，β-巯基乙醇现用现加。 （11）TE缓冲液(10 mmo1/LTris-HC1，pH 8.0；1 mmo1/L EDTA，pH 8.0)：取Tris-HCl溶液(pH 8.0)1 mL，EDTA(pH 8.0)0.2 mL，用双蒸水定容到100 mL，高压灭菌20 min。4℃保存。 （12）电泳缓冲液TAE（Tris-乙酸）的配制 50×TAE母液的配制：242.0 g Tris-Bace、57.1 mL冰乙酸、100 ml 0.5mo1/L EDTA(pH 8.0)，用双蒸水空容至1000 mL。 1×TAE电泳缓冲液的配制：取50×TAE 10 mL，再加入490 mL双蒸水，定容至500mL  方法 丝瓜DNA的提取与纯化 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从预处理过的丝瓜叶片中取出一到两片，做好标记备用： （1）称取1.5 g丝瓜预处理过的嫩叶片于预冷研钵中，置于液氮中，迅速研磨三到四次成粉末状。 （2）将粉末状材料转入10 mL的灭菌离心管中，立即加入3 mL 65℃预热的裂解缓冲液和60μL的β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温45 min间摇动离心管三到四次)。 （3）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（V/V/V=25/24/1），轻轻颠倒离心管匀，上部呈乳状液为止，室温下12000 r.min-1离心10 min。 （4）取上清液至10 mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异（V/V=24/1），轻轻颠倒离心管，混匀，室温下12 000 r.min-1离心10 min。 （5）把上清液转移到10 mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20°C预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置30 min。 （6）4℃下8000 r.min-1离心5 min，收集沉淀。倾去上清液，用75%（的乙醇漂洗沉淀2次（每次1 mL），将离心管倒置在吸水纸上，风干。 （7）沉淀用50μL TE缓冲液溶解，并加入0.5μL 10 mg/mL RNase，使RNA酶的终浓度为10μg/mL，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴45～60 min。 （8）在离心管加入TE缓冲液300μL，再用等体积的氯仿/异戊醇(V/V=24/1) 抽提，轻缓颠倒混匀，于4℃