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谢谢观看 * 专题九 生物科技与技术实践 0807508227 刘伟星 08计算机科学与技术医学应用2班 合成 逆转录 基因工程 ★目的基因的获取: 分为直接分离基因、人工合成基因。 目前，复杂的、尚不知核苷酸序列的基因不能合成 专一性最强，目的基因不含内含子，可以合成自然界中不存在的基因 通过测出的核苷酸序列，利用化学方法合成 根据已知氨基酸序列合成 操作麻烦，mRNA存在的时间短，技术要求高 专一性强，目的基因不含内含子 mRNA 单链 DNA 双链DNA 反转录法 人工合成法 基因表达载体的构建方法 重组DNA（环状重组质粒） 同一种限制酶切割 带有黏性 带有相同黏性末端的 末端切口 目的基因片段 载体（质粒） DNA分子（含目的基因） DNA连接酶 将目的基因导入受体细胞 原核细胞 受精卵 受精卵 体细胞 (需经组织 培养) 受体 细胞 感受态细胞法 (用Ca2+处理) 显微注射技术 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 常用 方法 微生物细胞 动物细胞 植物细胞 目的基因的检测与鉴定 导入检测:DNA 分子杂交技术 , 即使用放射性同位素标记的含目的基因的 DNA 片段作探针检测。 转录检测 : 分子杂交法 , 即目的基因表达检测 作探针与 mRNA 杂交 翻译检测 : 抗原—抗体杂交法 个体生物学水平鉴定: 转基因生物是否具有抗性或转基因产品的功能活性。 细胞工程 　　细胞工程包括动物细胞工程和植物细胞工程。 植物组织培养 　　植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物组织培养可培育繁殖速度快而且无病毒的植株,还可以通过大规模的植物、细胞培养来生产药物、食品添加剂、香料、色素和杀虫剂等,另外，还可用植物组织培养方法形成的胚状体,包裹上人工种皮,制成人工种子。 有根、芽或有生根发芽的能力 由愈伤组织成为 幼苗或胚状结构 再分化 ①离体 ②提供营养物质(有机 物、无机物) ③提供激素(生长素和细胞分裂素) ④提供其他适宜条件 排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞团 由外植体形成愈伤组织 脱分化 条件 形成体特点 过程 过程名称 植物组织培养与动物细胞培养 获得细胞的产物或细胞等 培育成细胞系或细胞株 液体:营养物质、动物血清等 细胞的增殖 动物细 胞培养 快速繁殖,培育无病毒植株等 培养成植株 固体：营养物质、激素 细胞的全能性 植物组 织培养 培养目的 结果 培养基 原理 项目 植物体细胞杂交和动物细胞融合 制备单克隆抗 体的技术 离心、电刺激、聚乙二醇、灭活病毒等试剂诱导 使细胞分散后,诱导细胞融合 细胞膜的流 动性 动物细 胞融合 克服远缘杂交 不亲和,获得杂种植株 离心、电刺激、聚乙二醇等试剂诱导 去除细胞壁后 诱导原生质体 融合 细胞膜的流 动性 植物体 细胞 杂交 用途 诱导手段 细胞融合方法 细胞融合原理 项目 单克隆抗体制备过程中的两个核心问题 ◎ 为何制备单克隆抗体要将单个 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合? 体内的 B 淋巴细胞数目很多 , 可以产生多达百万种以上的特异性抗体 , 这些抗体主要存在于动物体血清中, 也存在于组织液及外分泌液中。如果从动物血清中分离出所需要的抗体 , 不仅获得的抗体产量低 , 而且抗体的特异性差 , 纯度低 , 反应不灵敏。如果利用单个 B 淋巴细胞通过无性繁殖 , 就可产生大量单一抗体,但 B 淋巴细胞在体外不能无限增殖(从动物细胞培养的过程可以理解, 单个细胞要度过两次“危机”几乎是不可能的 ), 这就需要利用肿瘤细胞无限增殖的特点, 将单个 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合, 可以使杂种细胞具有两个亲本的遗传特性 , 也就是既具有无限增殖的特点, 又能产生单一抗体。 ◎制备过程中为何须经两次筛选 ? 第一次筛选是在 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合之后 , 因为有三种融合情况:B 淋巴细胞与 B 淋巴细胞融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合、 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。而只有 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合的细胞才是需要的杂种细胞。第二次筛选是在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。 胚胎