实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告.docVIP

实验六 纸层析法观察转氨基作用 【】а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的酶（T）如下反应：  α—酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸与水亲合力强 物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。 （三）实验材料与仪器： 试剂： 1、0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液。2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0 N NaOH仔细调至pH7.4后, 加磷酸盐缓冲液至100ml。 4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后，加磷酸盐缓冲液至100ml。 5、0.1mol/L 谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0 N NaOH仔细调至pH 7.4 后, 加磷酸盐缓冲液至50 ml。6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、cm圆滤纸、、手术剪刀取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸盐缓冲液1.0 ml,迅速研成匀浆用上述缓冲液.5ml混匀备用。 酶促反应过程（1）取离心管两支，编号：1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0. 5ml。把对照管放沸水浴中加热分钟，取出冷却。（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液1.5 ml,摇匀。（3）37℃保温，后取出 把测定管放沸水浴中煮分钟，取出后冷却取圆形滤纸一张（直径cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1 cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点（2）点样：用四根毛细玻璃管分别进行点样。把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。把测定液、对照液分别点在原点1、3处。注意点不宜过大（应在直径0.cm以下）。在第一次点样点干后，再在原处同样点2次。（3）层析：先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中。（）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入中，盖上培养皿盖可见沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。当前缘到离滤纸边缘约1cm时约分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，。 ％ （五）实验结果记录： 图（1） 点样溶液 色斑个数 溶质中心到原点中心的距离 溶质前缘到原点中心的距离 Rf值 测定管上清液 2 未知溶质a 1.50cm 2.50cm 0.6 未知溶质b 0.40cm 2.50cm 0.16 丙氨酸 1 1.30cm 2.20cm 0.6 对照管上清液 1 1.50cm 2.50cm 0.6 谷氨酸 1 0.40cm 2.20cm 0.16 表格（1） 实验讨论： 1、从表格（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。 2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。