放线菌的分离-周三2组(改).pptVIP

放线菌的分离纯化 周三下午2组 实验目的 从土壤中分离、纯化放线菌。 初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。 了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。 试验材料 药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂、重铬酸钾 其他：高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、酒精棉球、镊子、。 实验原理 土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链霉菌以外的其他放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。 对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量；用干热和苯酚处理减少链霉菌数量的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。 放线菌可以产生抗生素，抑制其他菌种的生长，故可用金黄色葡萄球菌（G+）和大肠杆菌（G-）作指示菌鉴别放线菌。 实验步骤 1.高氏一号合成培养基的制备:K2HPO4 ?3H2O 0.125g，可溶性淀粉5g，硝酸钾0.25, MgSO4?7H2O0.125g，FeSO4?7H2O 0.0025g，氯化钠0.125g，琼脂5g，水250ml。配制时，先依次加入上述药品（除琼脂外）顺序溶解，加入无菌水至250ml，调节pH＝7.4，再加入琼脂不断搅拌震荡至溶化后， 121℃灭菌20分钟(硫酸亚铁先配制100ml0.25g/ml溶液，再往培养基中加1ml即可） 2.编号，分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5、10-6）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，并加入1ml0.1%重铬酸钾待冷凝成平板 实验步骤 3.取10g土样，加90ml无菌水，振摇20min。取1ml土壤悬液加入盛9ml无菌水的大试管中混匀，即为10-1稀释液，类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的土壤溶液 4.用0.1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。静置10min后倒置培养。 5.置于28 ℃条件下恒温培养至长出菌落（7天左右）开始计数，观察。 实验步骤 6.纯化：将加热融化的高氏一号合成培养基倒平板，并标号。冷却后划线接种倒置28℃培养至长出菌落。 7.检测：在纯培养的平板上切取生长较好的放线菌落放入金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养基中（在火焰旁切取），置于28℃恒温箱培养1天后可观察是否有抑菌圈生成。 注意事项 放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱，地衣状。表面干燥。可作为鉴别菌种的基本参考依据。 添加重铬酸钾要适量（50ppm） 根据土壤中放线菌浓度选择相应的稀释倍数