第三章 基因表达系统 大肠杆菌表达系统.pptVIP

酵母表达系统 Pichia pastoris 表达系统 Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作为唯一的碳源. 易操作,培养容易 表达量高, 可达培养液中10 g/L 可以有真核生物的翻译后修饰, 如糖基化 避免了酿酒酵母的过糖基化问题 1. Pichia pastoris 的表达载体 Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子 胞外表达载体, pIC9K 3. 多拷贝产生，pIC9K, 体内形成多拷贝 pAO815 可体外构建多拷贝 4. 宿主细胞 Pichia Strain 基因型 转化后细胞的甲醇利用能力 pAO815和pPIC9K 在Sal I 、Stu I 单切, 在his 4插入（单交换），不破坏宿主的AOX1，转化GS115后产生： His +/Mut+ pAO815和pPIC9K 在Bgl II双切： 在5AOX1位点和3AOX1双交换，替换掉了宿主的AOX1基因， 转化后GS115产生 His +/Muts 技术路线 酵母菌转化 制备感受态细胞 1. 划线接种酵母菌，YPD平板， 30°C for two days. 2. 挑菌落于 10 ml YPD 30°C 摇过夜. 3. 转培养到 100 ml YPD，starting OD600 of 0.1 and grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀，液氮快速冷冻， -70°C保存。 保持感受态细胞在冰冻状态作转化！ Cell competence decreases very rapidly after the cells thaw even when held on ice. It is critical to add DNA to frozen cell samples. To perform multiple transformations, it is recommended to process them in groups of six at a time. Transformation 1. 10-50 μg DNA（20 μl液体中）， 直接加到 still-frozen tube of competent cells（40 μg of denatured and sonicated salmon sperm DNA）； 2. 37°C 水浴5分钟， 中间混匀两次； 3. 加 1.5 ml of Buffer B ， 彻底混匀； 4. 30°C水浴1 hour； 5. 2000 x g 离心10 ， RT， 去上清，细胞悬浮在 1.5 ml Buffer C中； 6. 离心后将细胞悬浮在 0.2 ml Buffer C中； 7. 将细胞涂布在选择培养平板（MD）上， 30°C for 3 to 4 days. 储存液 10X YNB (13.4% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate without amino acids) ，抽滤； 500X B (0.02% Biotin) ，抽滤； 10X D (20% Dextrose葡萄糖 )，抽滤； 10X M (5% Methanol)， 抽滤； 10X GY (10% Glycerol)，高压； 1 M potassium phosphate buffer, pH 6.0， 高压。 YPD培养基 Minimal Dextrose MD平板 成分：1.34% YNB（yeast nitrogen base，酵母培养基） 4 x 10-5 % biotin 2% dextrose 配制方法： 1. 800 ml 水， （平板加15 g agar），灭菌 20 ； 2. 冷却到 60°C ， 加100 ml of 10 X YNB，2 ml of 500 X biotin，100 ml of 10 X dextrose； 3. 倒平板。  BMGY： Buffered Glycerol-complex MediumBMMY： Buffered Methanol-complex Medium (1 liter) 成分：1% yeast extr