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选修3 专题一 基因工程（DNA重组技术） 操作环境：生物体外 操作对象：基因 操作水平：DNA分子水平 结果：人类需要的新的生物类型和生物产品 打破物种的界限，定向地改造生物的遗传性状 工具 DNA手术刀：限制性核酸内切酶（限制酶） 本质：蛋白质 作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶识别序列由6个核苷酸组成(EcoR1,SmaI)，少数由4，5或8个组成. 具有专一性 能识别特定的核苷酸序列 切割目的基因和载体 末端：黏性末端（识别序列的中心轴线两侧切开，如EcoR1） 平末端（识别序列的中心轴线切开，如SmaI） 分子缝合针：DNA连接酶 作用：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，无特异性，只要能互相配对就能催化缝合 发挥受温度，PH值影响 本质：蛋白质 EcoliDNA连接酶：只能连接黏性末端 T4DNA连接酶：可以连接黏性末端和平末端（平末端效率较低） DNA连接酶作用是催化其互相缝合，而粘合的方式是碱基相互配对形成氢键 和聚合酶不是一回事。聚合酶和DNA连接酶都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，但聚合酶需要DNA一条链作模板，作用对象是单个脱氧核苷酸，结果是形成DNA的一条链，DNA连接酶不需要模板，作用对象是游离的DNA片段（相同即互补的黏性末端），作用结果是形成完整的DNA分子。 分子运输车：通常使用质粒（来自细菌和酵母菌，属细胞质基因），还有?λ噬菌体的衍生物，动植物病毒，但经人工改造 作用：基因进入受体细胞的载体，把外源基因送入受体细胞 本质：DNA 质粒 特性：裸露，结构简单，独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力，很小的双链环状DNA分子 作为载体的原因 1.能自我复制（细胞内外皆可） 2.具有一个至多个 3.具有限制酶切割位点和标记基（四环素抗性基因，抗氨芐青霉素抗性基因）4.对受体细胞无害 基本操作程序（目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和鉴定） 目的基因（编码的蛋白质或具有调控作用的因子）的获取 从已有物种中分离 用人工方法合成 从基因文库中获取 文库类型 cDNA文库（专一性强， 但操作过程较麻烦，技术要求过高） 基因组文库（操作简单， 但工作量大，盲目性大，专一性差） 文库大小 小 大 具有启动作用的 DNA片段 无（要加入启动子，不然无法表达， 而且受体生物自身启动子比较有利基因表达） 有 位于编码蛋白质序列内 的非编码DNA片段 无 有 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以  PCR扩增技术 （聚合酶链式反应） 原理:DNA双链复制 关键：DNA聚合酶（Taq酶）能在高温中保持活性 目的基因DNA受热（90-95°）变性后解链为单链——引物（一小段DNA或RNA，作为DNA复制的起始点）与单链相应互补序列结合——DNA聚合酶的作用下进行延伸——形成指数增加 可在短时间内达到大量扩增的目的，但需要严格控制温度，技术要求高 人工合成（蛋白质工程）：可合成自然界不存在的新基因，但适用范围小，技术不成熟） 基因表达载体的构建（核心） 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时表达并发挥作用 表达载体：必须要有 启动子（RNA聚合酶识别和结合的部位）——插入基因——终止子（结尾特殊结构的DNA片段）.标记基因，复制原点 将目的基因导入受体细胞 植物 农杆菌转化法(在土壤里生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，在单子叶植物受损处涂酚类化合物也行) 原理：植物受伤，分泌酚类化合物，农杆菌被吸引，其中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上 过程：将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA（上有能控制限制酶和DNA连接酶的DNA片段）上，通过农杆菌感染 基因枪法（适用于单子叶植物，成本较高） 花粉管通道法（得抗虫棉，我国独创）：在植物授粉后，花粉形成的通道管还没愈合前剪去柱头，然后滴加含目的基因的DNA使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 动物 显微注射技术（超级小鼠） 过程：将含有目的基因表达载体提纯，DNA浓度保持在1—3μg/mL,从雌性动物中取卵，注射，然后在体内或体外受精，经胚胎早期培养一段时间后雌性动物的输卵管或子宫内 微生物（具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少的特点） Ca+处理细胞 以大肠杆菌为例，先用Ca+处理细胞使细胞处于感受态，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子 目的基因的检测与鉴定（都在体外进行） DNA分子杂交