植物组织培养7.ppt

一、植物原生质培养的目的和意义 二、原生质体分离 1、植物原生质体的分离方法 四、原生质体活力测定 b、共培养法 PEG诱导融合的特点： 其优点: 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 融合过程不受物种限制。 其缺点: 融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。 根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类： 对称融合（asymmetric fusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合（symmetric fusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种： 对称融合示意图 非对称融合的附图 非对称融合示意图 物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活； 化学处理目前常用的试剂有: 核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活的目的 用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： 1978年德国科学家梅歇尔斯等人把马铃薯(potato)和番茄(tomato)的原生质体融合获得了体细胞杂种“泡马豆”（pomato) 一、融合方法 PEG诱导融合法? PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。 - + - + - 桥梁 + + - - PEG被洗掉 + + - - 电荷重排 + + - - 原生质体膜接触 + + - 融合 示意 图 融合液： CaCl2·2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol pH 5.6诱导液：融合液＋PEG 20～45％稀释液：A液（g/100ml）pH6.0  B液（g/100ml）pH10.5 葡萄糖 7.21 甘氨酸 0.375 CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169 DMSO（二甲亚砜） 10ml P 1 融合液 P 2 混合静止1min. 选 择 P1 P2 加入PEG 培 养 融 合 加入稀释液 加入培养基 稀 释 洗 涤 2、电融合法 1979年：Senda首先实现原生质体融合交流电使原生质体排成串珠直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿 与PEG融合比较起来，电融合有三大优点： 一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分。 电融合的基本过程： 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串； 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、脉冲宽度、脉冲次数等。 电融合法原理 交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠 + - + - + - + - + - + - 负极 正极 + - + - + - + - + - 施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流 + - + - + -