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南方红豆杉的概况 种 名： 南方红豆杉 　　学 名： Taxus chinese 　　别名：刺柏松，紫杉，紫柏松 　　科属：红豆杉科、红豆杉属 　　保护等级：国家Ⅰ级重点保护野生植物（国务院1999年８月４日批准） 　　产地分布：产于我国长江流域以南，常生于海拔1000-1200m以下山林中，星散分布. 为什么要研究红豆杉 世界卫生组织（WHO）2008年12月9日发布报告称 2010年，癌症将超越心脏病成为全球头号杀手。而吸烟、摄入过多高脂肪食品、人口老龄化以及世界人口持续增长等因素是造成癌症患者与日俱增的原因。 WHO预计，在全球范围内，新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年1％的速度递增，而在中国、俄罗斯和印度这些国家增长速度会更快。 报告说：“全球癌症患者在上世纪最后30年里翻了一番，估计这一数字在2020年前将再翻一番，2030年前将增至上世纪最后30年的3倍。”这意味着到2030年，全球将新增2700万癌症病例，死于癌症的人数将达到1700万人。 紫杉醇一种高效的抗癌药物 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种四环二萜化合物, 也是目前所了解的一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。 紫杉醇是一种有丝分裂抑制剂，使肿瘤细胞停止在G2期和M期，直至死亡，进而起到抗肿瘤作用。 紫杉醇还可调节体内的免疫功能，对肿瘤细胞起杀伤或抑制作用。 通过Ⅱ-Ⅲ临床研究，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤有一定疗效。 紫杉醇合成研究 基于RACE技术的同源性克隆方法克隆了南方红豆杉中的两个基因（MCT和MCS） TcMCT和TcMCS基因的功能验证 TcMCT基因的原核表达和酶活测定 TcMCT基因的组织差异表达 TcMCT 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列 TcMCT三级结构预测 TcMCT基因的功能验证 TcMCT重组蛋白的诱导 过Ni-NTA亲和树脂纯化TcMCT重组蛋白的的SDS通过分子筛进一步纯化TcMCT蛋白 TcMCT重组蛋白含量测定 TcMCT重组蛋白的酶活性测定 TcMCT重组蛋白在25℃下的CD图谱 TcMCS全长cDNA序列的分析 TcMCS全长为1081-bp，包含一段长度为744bp的ORF及一段长度为16-bp的5-端非编码区和321-bp的3’端非编码区 编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白质 预测的分子量约为26.1kDa 等电点 (pI) 为8.97 TcMCS 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列 致谢 感谢导师廖志华教授的悉心指导 感谢师兄、师姐、师弟、师妹的帮助和支持 感谢在座的各位老师 “★”表示底物结合的活性位点 TcMCS氨基酸序列多重比对 基因克隆 TcMCS分别与Taxus media MCS((93.9% identity) 、 Cephalotaxus fortunei ( 73.7% identity) 、Ginkgo biloba MCS (61.7%identity)和Arabidopsis thaliana MCS (60.3% identity)具有很高的同源性。 研究结果与分析 TcMCS系统进化树 裸子植物来源的MCSs用〇表示，被子植物用?表示，细菌用▲表示，分支上的数字为Bootstrap值(重复1000次)。 基因克隆 研究结果与分析 TcMCS蛋白质三级结构预测 α-螺旋用红色螺旋表示，β-片层用黄色板状箭头表示，随机卷曲用绿色绳状表示。活性位点的残基(His79、His208、Asp212、Ser213、Glu216、Arg218、His223）在图上标注 基因克隆 TcMCS 单体 结构图 TcMCS行使功能和晶体堆积时均以三聚体形式存在，即三个亚基的β-折叠片面对面形成类β桶结构，α-螺旋包裹在亚基的外围。 研究结果与分析 TcMCS基因的功能验证 利用携带有pAC-BETA质粒的大肠杆菌菌株XL1-Blue来验证TcMCS蛋白的功能，通过转入携带有TcMCS基因的pTrc质粒， TcMCS在大肠杆菌中超表达，与pAC-BETA共同推动代谢流往下游流动，生产黄色的类胡萝卜素。 TcMCS基因的功能验证 功能验证 研究结果与分析 结论与展望 （1）首次从南方红豆杉中克隆出紫杉醇前体代谢途径中两个基因MCT 和MCS全长cDNA，对其进行了详尽的生物信息学分析； （2）原核表达TcMCT蛋白，Ni-NTA柱亲和层析获得约35KD的TcMCT重组蛋白。用圆二色谱仪对TcMCT进行二级结构测定，该重组蛋白中含有α-helix70.9%，β-sheet0%，β-turn 0%，random coil 29.1% 。重组蛋白