外周血表皮生长因子受体mRNA表达对大肠癌微转移和预后的临床意义.docVIP

外周血表皮生长因子受体mRNA表达对大肠癌微转移和预后的临床意义 　　作者：肖钟迪 梁春林 陈志奇 康德新 和利稼 白山 王勋 黄海涛 作者单位：大庆油田总医院普外科，黑龙江 大庆 163001 　　【摘要】 目的 检测大肠癌患者外周血中表皮生长因子受体(EGFR)并分析其临床意义。方法 应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测37例大肠癌及40例大肠良性病变患者外周血EGFR mRNA。结果 40例大肠良性病变患者外周血EGFR均为阴性。患者组EGFR mRNA表达阳性为45.9%(17/37)。EGFR mRNA表达阳性者在大肠癌Ducke′s分期中为A期28.6%(2/7)，B期31.3%(5/16)，C期80.0%(8/10)，D期50.0%(2/4);病理上低未分化(63.2%)及中高分化(28.7%)癌间经Χ2检验有显著差异(P0.05)。结论 RTPCR方法检测大肠癌患者外周血中EGFR mRNA表达与其临床及病理分期相关，此项指标检测可作为大肠癌微转移及预后的参考指标。 　　【关键词】 大肠癌 外周血 表皮生长因子受体 　　肿瘤的微转移及复发是影响其预后的重要因素，血液中肿瘤细胞的存在是肿瘤血性转移的物质基础，如何早期发现大肠癌患者血液中的肿瘤微转移是临床上比较棘手的问题。它不仅对判断大肠癌的转移和复发具有重要意义，而且对指导临床综合治疗也有重要价值〔1，2〕。本研究应用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测37例大肠癌患者外周血中的表皮生长因子受体(EGFR) mRNA的表达，并探讨其与大肠癌微转移及预后的临床病理关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 临床资料 　　患者组为我院住院大肠癌37例，男23例，女14例，年龄58～72 岁，平均(63±8)岁。每例术前3 d采外周静脉血5 ml,按1∶9比例加入枸橼酸钠混匀抗凝，立即送检。对照组为大肠良性病变患者40例，均排除合并有其他部位肿瘤的可能,采血方法同上。 　　1.2 试剂与方法 　　应用巢式PCR反应，试剂由上海生工生物公司提供。 　　1.2.1 标本制备 　　每份抗凝血按1∶1比例加入到淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，取单核细胞层和中性粒细胞层，用生理盐水洗涤3次，保存于-80℃备用。 　　1.2.2 总RNA提取 　　采用非超离心一步法。 　　1.2.3 逆转录反应 　　5×buffer 4 Μl，AMV 20 u，随机6聚体引物100 pmol/L,10 mmol/L dNTP 2 Μl,RNasin 20 u,10 Μg标本总RNA。反应体系20 Μl。逆转录：42℃ 55 min，95℃ 5 min。 　　1.2.4 PCR反应 　　选取EGFR的mRNA作为检测对象，同时检测Β肌动蛋白(ΒActin)作为检测合格的标志。本文根据国内外文献报道及这两个基因的特点设计引物如下〔3，4〕。 　　 EGFR引物序列 　　为了增强反应的特异性及灵敏度笔者采用巢式PCR。 　　A：5′TCTCAGCAACATGTCGATGG3′;B:5′TCGCACTTCTTACACTTGCG3′;C:5′TCACATCCATCTGGTACGTG3。 　　第一轮扩增用引物A和B，产生473 bp;第二轮扩增用引物A和C，产生322 bp。 　　 Β肌动蛋白引物序列 　　上游引物 5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′;下游引物 5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′。扩增产物154 bp。 　　 反应体系 　　10×buffer 5 Μl,引物2 Μl，5 mmol/L dNTP 5 Μl,TaqDNA聚合酶2.5 u，逆转录产物10 Μl，反应体系50 Μl。 　　 PCR反应程序 　　Β肌动蛋白：94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，以上3个温度共进行35个循环，最后72℃延伸10 min。EGFR：第一轮扩增95℃ 1 min，72℃ 2 min，以上2个温度共进行30个循环，最后72℃延伸10 min;第二轮扩增95℃ 1 min，69℃ 1 min，72℃ 1 min，以上3个温度共进行30个循环，最后72℃延伸10 min。 　　1.2.5 PCR产物分析 　　扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，用溴化乙锭(EB)染色在紫外灯下观察结果。 　　1.3 统计学处理 　　计数资料采用SPSS13.0软件进行Χ2检验。