含MDV部分gb基因、鸡Y一干扰素基因和EGFP基因表达盒.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 含MDV部分gb基因、鸡Y一干扰素基因和EGFP基因表达盒 HVT转移质粒载体pTu-gB-chIFN的构建 孙公军’，李银’，刘宇卓’，张则斌’，马玉玲’，张敬峰’，李劲松 ’，陈溥言’ (1南京农业大学动物医学院传染病组，210095;2江苏省农科院兽医所禽病室，210014) 近年来，基因工程活载体苗的研究十分活跃，国内外的学者相继报道了能够成功表达外源基因的多 种重组活载体疫苗，如禽痘病毒、疤疹病毒、腺病毒、沙门氏菌等等。但对于这些重组活载体疫苗来 说，除了考虑它们的安全性以外，抗原量表达不高也是其难以推广应用的限制性因素。因此，如何提高 活载体的免疫效果成为了国内外的研究热点。后来，随着研究的深入，人们渐渐地意识到细胞因子可以 作为一种高效、安全的免疫佐剂。尤其是y一千扰素，由于它具有较强的增强机体免疫调节的功能，受 到了人们更多的重视。国内外的研究也从不同的方面证实了它作为基因工程活载体疫苗免疫佐剂的可能 性 。 但是从现有的免疫学理论来看，干扰素作为抗病毒的治疗剂，对病毒具有抑制作用，而将干扰素基 因插入到病毒活载体以后，重组载体表达的干扰素在抑制外来病毒增殖的同时，也有可能干扰载体病毒 的复制。这就难以解释它可作基因工程活载体疫苗免疫佐剂的事实。为此我们将鸡y一干扰素基因 (chIFN-y)与MDV部分gB基因同时插入到了载体中，构建了可用于真核表达的转移质粒载体，旨 在为以后的真核表达打下基础，从而深入地研究鸡y一干扰素基因作为基因工程活载体疫苗免疫佐剂的 可能性及其作用机理，并制备含免疫佐剂的重组活载体疫苗。 1、材料与方法 1.1质粒与菌种:价-chIFN-y、pEGFP-C，以及宿主菌DH,。为江苏省农科院兽医所禽病室保存， pTK2B,pURMDV-EgB为南京农业大学传染病实验室保存。 1.2 试剂:PCR试剂盒、MiniBESTPlasmidPurificationKit,AgroseGelDNAPurification Kit、内切酶、DNAmarker均购自Takara公司，胰蛋白脉、酵母抽提物为 Oxiod产品;氨节青霉 素、卡那霉素购自罗氏公司;其它试剂均为国内分析纯。 1.3 引物设计:根据Genbank发表的序列，利用Primer5.0和DNAstar软件，设计了两对引物。 chIFN-yp,:5GATAAGCTTCAGCCATCACCAGGAAGAT3 chIFN-yp2:5GACCTGCAGAAGATGCCATTAGCAATT3 gBp,:5CCTAGATCTTATTTTAGGCGGAATTG3 gBp2:5TTAAAGCTTCTACCTGACCCATACC3 1.4 PCR扩增:chIFN-y和gB的扩增分别以pT-chIFN-y和pURMDV-EgB为模板进行PCR反 应。chIFN-y扩增的反应条件为94C5min,94V30s,61`C30s,72`C60s共35个循环;72C 延伸 10minogB扩增的反应条件为94C5min,94`C30s,580C60s,720C2.5min共35个循 环;72℃延伸10min。电泳检测扩增效果。 1.5 PCR产物的克隆:将chIFN-y和IB 的PCR产物用AgoseGelDNAPurificationKit回收，酶 切后先后插入到pEGFP-C1中，构建真核表达的基因表达盒。其中chIFN-y的PCR产物用PstI和 HindIII酶切，gB的PCR产物用BglII和HindIII酶切。感受态细胞的制备、外源基因的连接以及连 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立 20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 接产物的转化按 《分子克隆》中的方法进行。卡那霉素抗性及酶切鉴定阳性重组质粒。得到的重组质粒 依次命名为PC,-IFN.PC,-IFN-gB. 1.6 pTu-gB-chIFN的构建:pTK2B用NheI线性化、CIAP去磷酸化、Klenow补平;PC,-IFN-gB 用ApalI和NaeI酶切、Klenow补平。电泳回收后16℃连接12h.氨节青霉素抗性及酶切鉴定阳性 重组质粒。得到的重组质粒命名为pTu-gB-chIFN. 2、结果 2.1 PCR扩增 chIFN-y和gB的PCR扩增产物分别用 1%的琼脂糖凝胶电泳观察。可看到分别在 500bp. 2100bp左