基因克隆：高效感受态细胞制作.pdfVIP

中国试剂网 3.13.11.18 基因克隆：高效感受态细胞制作 方法一 A 液：1M，MnCl2 ： B 液：1M，HEPES ，pH=6.2-6.8 ，用无菌水配，配后不需灭菌； C 液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g ，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml 三蒸 水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放 入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 取 1 管B 液（0.6ml ），全部加入C 液(46ml) 中，混匀后，再用1ml 移液器加入 3.3ml A 液，混匀冰浴即可使用。 划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17 小时，挑取2-4 个形态饱满的单菌落接种 于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms ）培养3-4 小时, 将 培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms ）培养，其余与普通感受态差不多，每 管加入4ml TB 缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO （可用 国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP 管，冰上静置 15 分钟。用纱布将所有装 有感受态的 EP 管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置 12 小时 以上。取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。 效率非常高，一般可到 10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及 珍贵材料的连接转化。 洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超 过2500g,建议1500-2000g 5min。涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻 在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中 温浴2 小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30 分钟）这样会减少卫星菌落 出现。 预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液 时经常在室温倒置 1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液， 我经常加至20ml ，效果不错。 关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简 单的则是将LB 平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP 管冰箱即开始转化。对 于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。 中国试剂网 3.13.11.18 现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化，可达到 1010，但是操作起来比较麻 烦。要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于 1990 年《gene》上刊 登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。 根据实验室的实际情况，我们将其稍作修改，做成了 GLP 文件，但其中仍有许 多可改进或需要注意的地方，其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮 助。 1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章 上必讲的，毋庸置疑。 2 、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量 代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态 的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/ 三角瓶容量=100ml/500ml ， 50ml/250ml 。 3、培养基的pH 值。这是讲的pH 值并非单指配置或灭菌后的pH 值，而且还包 括整个摇瓶结束后的pH 值。一般来说，接种前的pH 值在6.8-7.2，等菌摇好后， 可以测一下pH 值，不要低于6.0，最好在6.5 以上。这表示菌体的代谢为有氧代 谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。 4 、培养后的OD 值。其实这并一个非常重要的参数，只是当OD 值大到一定的 程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD 不得 大于0.6，0.8 等等。同时，OD 值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一 点，因而需要在OD 值的两方面影响中找一个平衡点。 5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的 Mg2 离子时， 该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM