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酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系_医学论文 酪氨酸激酶Etk的表达与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系_医学论文 作者：苏珊 张健 郭琳琅 朱伟良 张振华 【摘要】 　　目的： 观察酪氨酸激酶Etk的表达与放射引起的鼻咽癌细胞株凋亡之间的关系，探讨Etk对放射引起的鼻咽癌细胞凋亡的调节机制. 方法： 运用免疫荧光技术和流式细胞术检测4株鼻咽癌细胞Etk的表达情况；直线加速器6MV射线2 Gy单次剂量照射细胞后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化，以及与Etk,凋亡相关蛋白Bcl及Bak表达的关系. 结果： 流式细胞仪检测显示4株鼻咽癌细胞Etk表达水平分别为：5（73.3±3.4）%, 6（50.5±6.1）%,CNE（47.7±1.9）%,CNE（29.5±1.7）%. 免疫荧光显示，Etk蛋白主要在鼻咽癌细胞胞质中表达，胞核中表达微弱. 统计分析表明，放射线照射后，鼻咽癌细胞株Etk的表达降低，并与细胞的凋亡率及Bak蛋白的表达呈负相关，与Bcl的表达无关. 结论： Etk蛋白与放射引起的鼻咽癌细胞凋亡有关，它可能通过调节凋亡蛋白Bak的表达参与了放射后鼻咽癌细胞的凋亡. 【关键词】 鼻咽肿瘤 蛋白质酪氨酸激酶 Etk 细胞凋亡 0引言 内皮/上皮细胞酪氨酸激酶 (The endothelial/epithelial tyrosine kinase, Etk)，是蛋白酪氨酸激酶（Bruton）家族中惟一一种不仅分布于淋巴造血细胞，还在上皮性瘤细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶［1］. 国外研究表明，Etk与T, B淋巴细胞的增殖、分化关系密切，并对乳腺癌、前列腺癌等癌细胞的增殖和凋亡起重要的调节作用［2-3］. 我们最近报道，在鼻咽癌组织中也存在Etk的异常表达，并与EBER（EBV Encoded RNA）的表达相关,而与凋亡相关蛋白Bcl的表达无关［4］. 本研究我们利用直线加速器对鼻咽癌细胞进行照射，用流式细胞仪检测照射前后细胞的凋亡率及Etk，Bcl和Bak的表达，探讨Etk与放射后鼻咽癌细胞凋亡之间的关系及其可能调节机制. 1材料和方法 1.1材料兔抗人Etk多克隆抗体购自美国Cell Singnaling公司；FITC标记羊抗兔IgG购自美国CHEMICON公司；兔抗人Bak多克隆抗体及兔抗人Bcl多克隆抗体购自福州迈新生物技术公司；Annexin V凋亡试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；RMPI 1640培养液购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自奥地利PAA公司. 细胞株：高成瘤、高转移的低分化鳞癌细胞株5及低成瘤、不转移的低分化鳞癌细胞株6由南方医科大学病理学研究室馈赠,高分化细胞株CNE低分化细胞株CNE由中山医科大学病理学研究室馈赠. 1.2方法 1.2.1细胞培养加入含150 mL/L灭活新生牛血清的RMPI1640培养液，置于37.5℃，饱和湿度50 mL/L的CO2培养箱中培养. 收集融合率70%~80%，存活细胞百分率gt95%的对数生长期细胞以备实验. 1.2.2免疫荧光技术鼻咽癌细胞在预处理过的盖玻片上培养24 h至70%~80%细胞融合，PBS洗涤3次，丙酮冰上固定15 min，洗涤3次后加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），37℃温育2 h，洗涤后加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），37℃温育1 h，PBS洗涤后封片，于荧光显微镜下观察. 1.2.3直线加速器照射产地：美国Varian公司，6MV射线，剂量2 Gy，剂量率4 Gy/min ,照射野15 cm×30 cm. 1.2.4流式细胞仪分析① 鼻咽癌细胞株照射前后Etk的表达：分别收集照射前与照射后6,12 h的鼻咽癌细胞，50 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后，破膜剂裂解细胞，加入兔抗人Etk多抗（稀释浓度1∶100），孵育1 h，再次洗涤离心，加入FITC标记羊抗兔IgG抗体（稀释浓度1∶50），孵育0.5 h后，在流式细胞仪上检测Etk蛋白的表达，出现绿色荧光的细胞为Etk蛋白表达阳性. ② 采用上述相同的方法，检测放射线照射前后细胞Bcl蛋白的表达水平. ③ 照射后鼻咽癌细胞的凋亡率：收集照射后12 h的鼻咽癌细胞，PBS洗涤离心后， 1×binding buffer (结合缓冲液)调整细胞浓度为5×109/L，取100 μL与5 μL FITC及2.5 μL PI溶液混匀，冰上避光孵育10 min，加入400 μL 1×binding buffer混匀后，应用美国Becton Dickson 公司的FACSort型流式细胞仪进行分析. 统计学处理： 数据采用统计软件SPSS10.0，结果用x±s表示，差异比较采用t检验，并进行Sp