重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性_医学论文.docVIP

重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性_医学论文 重组信号分子GRF的PH结构域抑制蛋白激酶C活性_医学论文 作者：季少平　药立波　韩月恒　刘新平　苏成芝 【关键词】 信号分子 　　关键词: 信号分子鸟苷酸类PH结构域蛋白激酶C活性 　　摘 要:目的 鉴定表达guanine-nucleotide-releasing factor（GRF）的pleckstrin homology（PH）结构域与谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白的可溶性，并进一步检测该重组蛋白与蛋白激酶C（PKC）的结合及对PKC活性的影响. 方法 将表达GRF的PH结构域与GST融合蛋白的菌体经超声裂解，上清中的融合蛋白用琼脂糖珠锚定纯化.Western blot检测融合蛋白与PKC的结合，以PKC活性检测试剂盒测定结合后PKC的活性变化. 结果 获得信号分子GRF的PH结构域-GST融合蛋白的可溶性表达.Western blot结果表明，GRF的PH结构域可在体外与PKC结合.PKC活性实验显示，GRF的PH结构域抑制PKC活性. 结论 GRF的PH结构域可在体外与PKC结合并对PKC的活性具有下调作用. 　　Keywords:signaling moleculeguanine-nucleotide-releasing factor for RasPH domainprotein kinase Cac-tivity 　　Abstract:AIM To investigate association of guanine-nu-cleotide-releasing factor for Ras（GRF）PH domain and pro-tein kinase C（PKC）and to examine effect of GRF PH do-main on activity of protein kinase C.METHODS GRF PH domain-GST fusion protein was expressed in E.coli and puri-fied by glutathione agarose beads.The expressed fusion pro-Tel.（029）3374516 Email.jishaoping@ tein was harvested by lysing the E.coli with ultrasonic.After centrifugation，the fusion protein in supernatant was purified by glutathione agarose beads.Western blot was employed to confirm the binding of the PH domain with PKC in vitro.To detect change of PKC activity after the fusion protein binding to PKC，PKC activity was examined with TECTTM PKC as-say system.RESULTS Association of PKC with GRF PH domain was detected out by Western blot，and the PH do-main down-regulated the activity of PKC.CONCLUSION Recombinant GRF PH domain binds to PKC and inhibits its kinase activity in vitro. 　　0 引言 　　我们以前克隆表达了GRF（guanine-nucleotide-releasing factor for Ras）的PH结构域［1］ ，现进一步研究其与PKC间的相互调节关系.GRF属小G蛋白家族，大鼠GRF由1244个氨基酸构成，其中包括两个PH结构域，分别位于22～129位和452～580位氨基酸［2］ .Ras蛋白是多种信号转导途径的核心.许多受体信号经过一系列的细胞内转导，在小G蛋白家族的介导下使GTP与Ras蛋白结合并激活Ras，从而启动Ras-Raf-MAPK信号系统［3］ .当用Ras抗体或将Ras突变可明显阻断这些受体所介导的功能.在这一过程中，GTP与Ras蛋白结合可由GRF催化［2］ .另一方面，GRF能刺激GDP与Ras的解离，促使GTP与Ras的结合.将GRF和Ras共表达于COS7细胞，可检测到GTP结合形式Ras的聚集［4］ .目前，有关GRF与PKC之间相互作用我们所知甚少.