人MCP与CD59双基因导入昆明小鼠的整合及传代研究.pdfVIP

第五届中南地区实验动物科技交流套 论文汇编 人MCP和CD59双基因导入 昆明小鼠的整合及传代研究’ 魏雁，郑新民，李莉，乔宪风，刘西梅，周荆荣，田永祥，魏庆信 (湖北省农科院畜牧兽医研究所，武汉4300“) 【摘要】将人MCP(膜辅目子蛋白)和CD。(膜反应性溶解抑制物)两种基因采 用混合注射的方法，导入521枚昆明小鼠的受精卵原核，得到原代转CD5，基因小鼠14 只，CD∞的整合率为18．4％；转MCP基因小鼠12只，MCP的整合率为15．7％；转CD59 +MCP基因小鼠7只，双基因整合率为9．2％；转基因效率5％。通过5只存活的G0 代转双基因小鼠和非转基因小鼠的繁殖，得到F1转MCP小鼠14只，转cD，小鼠16 只，转双基因小鼠10只；F，双基因占33．3％。 【关键词】MCP、cD…转双基因小鼠 【中图分类号】Q9S一3 随着免疫抑制研究的进展和外科手术的不断成熟，器官移植已成为许多终末期器官衰竭疾病的 首选治疗方案。但供器官的严重不足，使许多患者在等待中死亡。于是越来越多的学者将目光锁定 在异种器官移植上。但是异种器官移植目前最大的障碍是免疫屏障，首当其冲的是超急性排斥反应 (HAR)。HAR发生的关键环节主要是补体激活，所以补体调节蛋白(CRP)成为目前国际上研究的 建转基因猪，我们已成功地克服了异种HAR的发生“1。然而这一结果离预期的存活时间还有一定 的差距。离体实验证实联合转染两个或两个以上CRP基因较转染单一CtIP基因对异种细胞有更好 的保护作用。Adams等人证实联合转染CD，，和DAF的转基因猪心脏能够更好的克服HAR”1。陈实 细胞的保护作用明显优于单独使用CD。DAF或MCP口】。基于上述的理由，本试验采用双基因混合 原核注射的方法，构建了转CD。+MCP双基因小鼠，并且对获得的原代(Go)转双基因小鼠进行了 传代，为异种移植研究提供动物模型，为下一步构建转双基因猪提供方法和依据。 l材料和方法 ， I．1主要试矶夏仪器 孕马血清促性腺激素(PMSG，天津华孚高新生物技术公司)，人绒毛膜促性腺激素(HCG，南京动 剖镜，倒置显微镜，显微操作仪，培养皿，凹玻片，拉针仪，熔锻仪，磨针器，PCR仪。电泳仪等。 1．2原代转基因小鼠(CO)的构建 ·基金项目：国家863计划资助项目(2001AM,160T1) 作者简舟：魏雁(1974一)，女．研究实习员 论文汇编 第五届中南地区实验动物科技交流会 1．2．I的基因的准备 将武汉大学李文鑫提供的CD。质粒，用BgIⅡ和SmaI双酶切后，回收2．5kb的含CD∞cDNA 段按拷贝数I：I混合，稀释浓度为5ug／ml，待注射。 1．2．2供体小鼠的超排和配种 (I：I)，第二天清晨检栓，有阴道栓者为受精卵供体小鼠。 1．2．3结扎雄性小鼠和假孕母鼠的准备 将6—8周龄的KM公鼠，麻醉，腹部手术，将两侧的输精管结扎。缝合，休息4周以上备用。在 供体小鼠合笼的同一天，将准备做受体的雌性小鼠与结扎公鼠合笼(I：1)。第二天清晨检查阴栓，有 阴道栓者为假孕母鼠。 1．2．4受精卵的获取 颈部脱臼处死有阴栓的供f奉小鼠，剪开腹部皮肤和肌肉，暴露腹腔，剪下输卵管置于200ul的M： 液滴中，在体视显微镜下撕开输卵管壶腹部，让包裹着颗粒细胞的卵丘细胞流出来。然后将卵丘细 中洗涤4—5遍，清洗以后移人80ulMl6培养基中，置于37℃，5％C02的培养箱中培养。 1．2．5显微注射 在凹玻片的中央滴一滴M2培养液，移入10-20枚受精卵，用矿物油将液滴覆盖。用持卵针吸 住受精卵，在显微操作仪下，将含有DNA的注射针刺入受精卵的雄原核，注入DNA溶液，待看到雄 原核略有膨胀，迅速退出注射针。用此方法注射完所有的受精卵，然后放人另外一个含有80ulM。。培 养基中培养。 1．2．6胚胎移植 取同一天见阴栓的假孕小鼠，麻醉，去毛，肷部剪开0．5cm的小口，尽量避开血管，拉出输卵管及 卵巢，并且将输卵管和卵巢问的膜撕开一个小缺口，移卵针