真鲷肿瘤坏死因子α(TNFα)基因的克隆和表达的研究.pdfVIP

真鲷肿瘤坏死因子仅(TNFa)基因的克隆与表达的研究 蔡中华1．一，宋林生1，高春萍3，是龙涛1，丘利华1，相建海t (1。孛国耪学院海洋研究所，出东膏岛255071； 2．天津农学院，天津3003M；3．中圆海洋大学山东膏岛266003) 摘要采用同源克隆的方法，根据近邻物种TNFot基因序列设计兼并引物，农真鲷中党隆得到了 256bp戆INFot基嚣装麓嚣冀黪。采用寒蟪快速竞隆(嗍)魏方法，获褥了该基莲懿念基嚣缡毽痔列。该 基因推导的氨基酸序列没有槠基化位点和信号肽区域，便是有一明显的跨膜区域，属膜结合礞白；该撼因 载氨基酸净列含有一竣确蛹霹曦家族签名痃列模式和耪多耱结合位点及缎戆黏瓣位点，与该基嚣骢功能 密切相关。由该基因全序列构建的避化树表明，该基因等哺乳类TNVct和诮邵都具有较高的同源性，分别 属于不同的进化分交，但是经该基因序列的一级结构和二级结构以及基因表达研究分析，表明该基因是 徽霭不是卿。表达繇究袭明，奏绢TNTa存在结榜黧移诱导羹表达耀释形式，表魂荛刺激毒菲裁激酶 真鲷中，TNFct基因均可在部分组织中表达；但是在受刺激鱼体上，藻因表达的组织分布显著增多。 关键词真鲠；瓣瘤巧死嬲子舭)；克渣；袭达 necrosis 肿瘤坏死因子(Tumor 伤菜些魏癌缁脆著使耱瘙组织发生环死豹嚣子。静晤霉森多释缨藏分泌，瑟骞广泛熬生耱学溪性，在不彩璃祝体正常缀臆豹 前提下，在体内外均能特异性地杀死某魑肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的增殖；参与机体的免疫调节，诱导桐关细胞因子及其受体 基因的表达势调控炎症和发热反应，存广泛的生物学效应¨-2J。崤乳类TNF可以分为’嬲a秘张邵，时旺k由单核细胞、题嗜 细胞、NK细胞以及平滑肌细胞、成纤维细胞等经LPS、细胞因子、免疫复合物以及肿瘸细胞等多种物质刺激产生；”邳又称淋 学溪性，匹毙囊缀懿墨孵藏耍}罨致缨戆键亡，劳霹裕秀第二信使奔警缨照毒性反应及信号传髻，蘧节特异性秘嚣特异性免疫 反应。人们常说的肿瘤坏死因子泛指TNFct，而且TNFoc比卿拥有更强的生物学活性。【3一j 并开始尝试应用基因道组技术对该基因进行体外重组与表达【15—16』，为进一步研究敦抗病机理，开发其在生产上的应用奠定 基础。 真鲷(p擗惜Major)是我嚣蓬要的海水鱼类养疆箍释，因其痰质鲜美，色彩鲜艳，蕴育吉祥，多年来一盏深受入们静喜爱， 是我国重要的出口创汇养殖种类。近年来，水产养殖病害日渐猖獗，给我国的养殖产业带来巨大的损失。为摆脱养殖业的被 动麓嚣，增强养殖燕释蕊病力，舞发叛型承产药锈，我弱采耀嗣源纛隆豹策略，对奏鲷熬静瘤坏死因子(疑旺电)基爨送行壳逢， 并对其表达调控规律进行了初步探索。’ 1材料与方法 基金疆蠢：国家863青年藜金(2001AA628118)；歪窕城薄童詹奖聚蒸金(20011002110140) *通讯作者：E—mail：hhsong@ms．qdlo．ac．cfI ·739· 第一届海洋生耪高技术论坛论文集 1．1 实验鱼 本实验用鱼均为购自山农省青岛市南山市场的健康成鱼，体黧约7009，予流水实验槽中控温暂养一周。警赛期闻水温 22*-212，溶氧约6mg／L，每El投疆约占镕重1．5*／oN商品人工配合诲料。 l。2真鲷总RNA的提取与反转录 用新鲜培养的鲮弧菌(莫照兰博士惠赠)，以网心腔洗射的方式感染经暂养的健康真鲷，约1泸菌／ks鱼。24h后，分别取 感染鱼的头肾和脾脏等免疫相关器官进行匀浆，并以Trizol 鸯穰板，以蕊go 1。3 TNFa同源序列的克隆 根据近源物种TNFa序列的保守区域设计简并引物dIF(5’C1ETACTICuI℃TACHBC CIZ； ACC GAABACTNG PCR扩增。PCR反应体系为：l钕PCR获应缓i串液5蓝，25mmol／LM9023t,L，2．5mraol／L DNAMarker舞对照， 45s，72℃延{睾45s；1个锤强，