实验十药敏试验.docVIP

实验十药敏试验 药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），环丙沙星（CIP），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新诺明（SMZ）。 （一）实验目的 1.了解化学药剂的杀菌和消毒作用，学习纸片扩散法测定该细菌对某种药物的敏感程度。 2.掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。 一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀死作用。因此，在实验室内和生产中常利用某些化学药剂进行杀菌或或消毒。不同的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能力不同，此外，药剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不同。本实验所用的方法为Bauer-Kirby法，即常用的纸片法。其原理是将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上。 经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌环。测量抑菌环的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。 1.活材料：培养24h的大肠杆菌或葡萄球菌、沙门氏菌斜面菌种。 2.培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，药敏片（1g/L HgCl2，0.2mg/L链霉素， 0.2mg/L青霉素，50g/L石炭酸，或其它种类消毒剂、抗生素。） 3.器材：无菌平皿，无菌水，无菌吸管，玻璃 刮铲，无菌镊子。 1.制平板：取无菌平皿，将已溶化并冷却至50oC左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌 操作法倒入平皿中， 使之冷凝成平板。 2.取无菌水，用接种环取菌种1-2环接入无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液。3.接种：用无菌吸管吸取已制好的菌悬液0.1ml接种于平板上，用无菌玻璃刮铲涂匀。 4.用无菌镊子将浸药滤纸片分别平铺于含菌平板上，注意药片放好后不要移动，并在平皿背面做好标记。 5.将平皿置于37oC下培养24h观察结果。取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈的大小。将测量结 果记录下来。附录：药物纸片的制备：取普通滤纸用打 洞机打成直径6mm的圆形纸片，浸于一定浓 度的抗生素中。(1) 制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。 (2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。?过期纸片不能使用, 应弃去。 (3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。 (4) 保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。 3.质量控制 质量控制方法 是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。